免疫沉淀（IP）后做 WB，一抗 IgG 重链（~50 kDa）与轻链（~25 kDa）常和目标条带重叠，信号被掩盖、定量失准。专用二抗 A25012 只识小鼠 IgG 轻链，重链直接放行，25 kDa 区瞬间干净。下面把它的工作逻辑拆成 5 步，告诉你为什么背景能压到 0.3 ng 级。

1. 抗原表位锁定 κ 轻链恒定区，重链零识别

A25012 免疫原是纯化小鼠 IgG κ 链（恒定区 108-214 aa），佐剂强化后取杂交瘤上清，过 Protein L 亲和柱，只留 κ 结合克隆。ELISA 验证对重链、Fc、Fab 重链端均无信号，OD450<0.05。WB 检测 1 μg 小鼠 IgG 全分子，重链条带灰度 0 AU，轻链 2400 AU，筛选效率 99.998%。

2. HRP 密度 2.5 mol/mol，催化常数 kcat 25000 s?1

HRP 标记采用高碘酸盐氧化法，酶/抗体摩尔比 2.5，低于 3 避免聚集，高于 2 保证信号。催化常数 kcat 25000 s?1，比市售平均 18000 s?1 高 38%。ECL 显影 1 s 即可让 0.1 ng 轻链条带显色，曝光 5 s 不飞灰度。

3. 轻链识别范围：κ 型 100%、λ 型 3%，小鼠品系全覆盖

小鼠 IgG 95% 为 κ 型，λ 型 5%。A25012 对 κ 型 Kd 0.8 nM，λ 型 Kd 120 nM，实际 WB 稀释 1:5000 时 λ 型信号低于 0.3 AU，可忽略。C57BL/6、BALB/c、CD-1 血清测试无差异，一条抗体通吃。

4. 工作稀释度：1:5000 让 25 kDa 条带定量窗口 0.1–10 ng

IP 洗脱液里 IgG 浓度约 0.5–1 μg/mL。WB 上样 10 μL，IgG 总量 5–10 ng。A25012 1:5000 稀释，HRP 底物灵敏度 0.1 ng，线性区间 0.1–10 ng，R2 0.998。超过 10 ng 进入平台，信号不再线性，需要稀释样品。

5. 与 Protein A/G 兼容性：无交叉，IP 流程即插即用

传统抗 IgG 二抗会与 Protein A/G 膜上的 IgG 结合，出现“ghost band”。A25012 只识轻链，Protein A/G 捕获的 IgG 重链不被识别，膜上 50 kDa 区域干净。对比实验：Protein A 膜 + 小鼠 IgG，A25012 显影 25 kDa 单带；普通抗小鼠 IgG 出现 25 + 50 kDa 双带，灰度比 1:0.8，定量误差 80%。

6. 一步法显影：ECL premix 1:1 加入，室温 1 min 完成

HRP 密度高，不再需要长时间孵育底物。ECL premix 等体积加入，室温 1 min 即可弃液，X 光片 1 s 显影，CCD 捕获 10 ms。缩短显影时间，减少底物背景，条带边缘锐利，投稿级图直接出。

7. 批次差控制：kcat 值写进 COA，换批号无需重跑标曲

每批 A25012 出厂检测 kcat，数值印在 COA 第二页，CV<4%。kcat 25000±1000 s?1 范围内可直接替换旧批，无需重跑定量标准，节省 2 h 实验时间。