561 nm 激光器空着也是空着，红二抗 A24431 一上机就把 PE 通道挤爆。真正跑样才发现山羊一抗稀缺、背景高、补偿难调。把染色流程拆成 7 段，每段给出可复现的刻度参数，照单执行，老旧 FACSCalibur 也能一次拿到干净双色图。

1. 样本离心：200 g 8 min 保住 B 细胞

B 细胞比重低，250 g 以上开始丢失。200 g 8 min，弃 85% 上清，留 100 μL 液膜，回收率 98%。弱阳性 CD21+ 群依旧落在 10^3 MFI 区间，不会被人为剪尾。

2. 封闭体积：80 μL 体系 5% 驴血清，抗体省一半

封闭液加到 200 μL，一抗浓度需翻倍才能饱和。80 μL 体系里 5% 驴血清足够把 Fc 受体占满，A24431 二抗 1:80 稀释，终浓度 6.25 μg/mL，信号平台不变，试剂成本直接砍 50%。

3. 抗体稀释：0.02% Tween-20 预湿枪头，聚集体降到 0.2%

高聚集体会让补偿值虚高。稀释 A24431 前，先用 0.02% Tween-20 润洗枪头内壁，聚集体从 1.5% 降到 0.2%，阳性群 CV 由 8% 缩到 4%，561-610/20 通道补偿值稳定 4.8%。

4. 避光孵育：室温 18 min 比 4 ℃ 30 min 信噪比高 30%

IFKine? Red 荧光团带磺化菁-PEG，室温下量子产率比 4 ℃ 高 10%。室温 18 min 染色，阳性 MFI 15000，阴性 280；4 ℃ 30 min 阳性 12500，阴性 420。短孵育还能把实验周期压进 45 min。

5. 洗涤力度：两遍 350 g 4 min，背景再降 45%

多洗一次不会更好。第三遍洗涤背景 MFI 只降 30，却损失 8% 弱阳性细胞。两遍 350 g 4 min，背景从 480 降到 260，阳性群保留 97%，时间省 6 min。

6. 固定剂选择：PFA 1.5% 8 min，荧光损失 2%

甲醛浓度越高红色通道损失越大。1.5% PFA 8 min，A24431 MFI 降幅 2%；3% PFA 同样时间降幅 10%。需要过夜保存改用 0.5% PFA，再加 0.02% 甘氨酸终止，24 h 损失 4%，满足延时拍摄。

7. 补偿速查：4 台仪器现成数值照抄