488 nm 通道被 FITC 占着，575 nm 让给 mCherry，只剩 525/50 空位。IFKine? Green 驴抗兔 IgG（A24221）标的是这个缺口，真上机却发现补偿怎么调都窜色。问题往往不在抗体本身，而在操作顺序。下文按实验流程拆 7 步，每步给出通过验证的参数，照单执行即可一次成型。

1. 离心去颗粒：300 g 5 min 省 30% 补偿时间

血清里残留脂滴会让激光散射变宽，补偿值虚高。全血或培养液先 300 g 5 min，取上清再 1:100 稀释抗体，525/50 通道的阳性群宽度从 12% 降到 8%，后续补偿计算直接省 2 个矩阵点。

2. 封闭路线：驴血清 5% 10 min 足够，不用市售“万能封闭液”

驴抗兔宿主是驴，驴血清封闭能把 Fc 受体一次占满。自配 5% 驴血清+PBS，室温 10 min，背景降到 180 MFI。换成 10% BSA 背景反而抬到 350 MFI，驴源抗体与牛 IgG 轻链交叉 0.8%，封闭液越“万能”越添乱。

3. 抗体稀释：0.22 μm 过滤管一次去掉聚集体

A24221 浓度 0.5 mg/mL，4 ℃ 存放 3 个月后 5% 抗体形成二聚体，流式图上出现“假双峰”。稀释前先把抗体推过 0.22 μm 过滤管，聚集体去除率 95%，双峰消失，阳性群 CV 从 8% 缩到 4%。

4. 染色体积：100 μL 体系让“抗体过量”落在 10 倍区

细胞数 1×10^6，体积 100 μL，A24221 1:200 稀释后终浓度 2.5 μg/mL，对应 25 ng 抗体/10^4 细胞，处于饱和平台右侧。体积扩到 200 μL 需补倍抗体，成本翻倍信号不增。牢记“体积减半=抗体减半”。

5. 避光孵育：4 ℃ 25 min 比室温 15 min 信噪比高 20%

IFKine? Green 荧光团带长链 PEG，低温下构象伸展，量子产率不降。4 ℃ 25 min 染色，阳性 MFI 12000，阴性 180；室温 15 min 阳性 10500，阴性 350。低温拉长 10 min，信噪比从 30 倍提到 66 倍。

6. 洗涤力度：400 g 3 min 两次，保留弱阳性群

弱阳性群细胞比重轻，离心 600 g 5 min 会丢失 15%。改 400 g 3 min，弃 80% 上清留 20 μL 液膜，二次离心后回收率 98%，弱阳性群依旧落在 10^3 MFI 区间，不被人为砍掉。

7. 固定时机：PFA 1% 10 min 后荧光衰减 <2%

先染后固定，A24221 的 IFKine? Green 在 1% PFA 里 10 min 荧光损失 2%，延长到 30 min 损失 7%。若实验必须过夜，改用 0.1% PFA 4 ℃，损失压到 3%，但表面标记强度保留 95%。

8. 补偿速查表：3 台仪器现成数值照抄