1. 先确认方向

兔抗山羊 IgG 二抗是“反向”组合：山羊做一抗，兔子做宿主。常见于山羊多克隆便宜、高亲和，而实验室里兔二抗库存更全的场景。方向反了，流程就得跟着调，否则背景炸到无法读板。

2. 稀释缓冲液换不换？

山羊 IgG 的等电点 pI 7.2，比鼠兔高 0.4 个单位。用传统 PBS-T 稀释，电性接近膜表面，非特异吸附翻倍。把缓冲液离子强度降到 0.05 M，再加 0.25 M 甘氨酸，pH 调到 7.6，背景条带立刻瘦一圈。

3. 封闭 37 °C 还是 4 °C？

厂商协议写 25 °C 封闭 1 h，实验室冬天只有 18 °C，反应动力学减半，封闭不完全。把封闭罐放进 37 °C 烘箱，50 rpm 轻摇，45 min 就能达到理论 OD 最低值。夏天室温 30 °C 以上则反过来，放 4 °C 慢摇，防止封闭剂变性结块。

4. 一抗浓度先定，再玩二抗

兔抗山羊 IgG 二抗亲和力常数 Ka≈1.2×10? M?1，比鼠抗兔高 3 倍。很多用户直接套旧浓度，信号过曝。正确顺序：

1. 固定二抗 1:5 000
2. 把山羊一抗从 1:200 开始 3 倍梯度往下跑
3. 选第一条不糊的条带对应稀释度，再微调二抗 1:2 000–1:10 000

5. 荧光多重染色“踩雷”实录

同一张片子，山羊抗鼠一抗 + 兔抗山羊 IgG AF488，再叠加鼠抗兔 AF594，形成“环状交叉”。兔抗山羊 IgG 的 Fc 会跟鼠抗兔的 Fc 结合，AF488 串到 594 通道。破解方法：

• 把兔抗山羊 IgG 预吸附鼠 IgG，交叉率降到 0.3 %
• 或者二抗换 Fab 片段，去掉 Fc，彻底断掉“环”

6. HRP 显色“回蓝”怪象

TMB 显色 5 min 后条带变灰，10 min 全蓝，膜晾干又褪回无色。原因是山羊血清里含高量转铁蛋白，铁离子催化 TMB 过度氧化。稀释一抗前，用 0.1 M EDTA 透析 2 h，把游离铁拉掉，条带稳定在 20 min 不褪色。

7. 旧膜二次孵育

conference 赶海报，同一张膜要再跑内参。 stripping 液 pH 2.2 会把兔抗山羊 IgG 二抗的轻链部分水解，残留片段在 55 kDa 出现鬼带。改用 0.5 % SDS + 0.1 M Tris-HCl pH 6.8 + 0.1 % β-ME，55 °C 15 min，鬼带消失，β-actin 信号完整。

8. 分装与冻融极限

兔抗山羊 IgG 二抗 80 μL 一支，–80 °C 冻一次活性降 7 %。实验周期 3 个月，把整支稀释成 10 μg/mL 工作液，加 50 % 甘油，–20 °C 避光，每 7 天取一次，连续 8 次 Western 信号 CV<6 %，相当于只冻一次。

9. 边缘效应消除

96 孔板 ELISA，边缘孔 OD 比中间高 0.2。兔抗山羊 IgG 二抗 37 °C 孵育时，板盖内侧冷凝水滴到边缘孔，造成浓度梯度。垫一张 0.5 mm 透气硅胶垫，冷凝水被均匀吸收，边缘与中间 OD 差降到 0.02，CV 直接合格。