到货验收先做“体检”

原瓶4 ℃缓霜后立刻离心1 min 2000 ×g，把挂壁液滴收到底部。测OD280 ×1.4估算浓度，误差>10%直接退货；HRP版本顺手测RZ=A403/A280，<0.4代表酶活已损失过半，ECL信号会提前衰竭。把数值拍照存档，后续出现批次纠纷可以秒回邮件。

分装体积算到微升级

每次实验用量+10%富余，50 μL是WB常用临界点，低于30 μL蒸发量占比陡升。用0.5 mL低蛋白吸附管，锥形底减少死角，管盖写日期+批号，-80 ℃铝箔避光。荧光标记版多包两层铝箔，冻存结霜后字迹会消失，贴标签前加一层透明胶。

冻融循环硬上限

原液含50%甘油，-20 ℃仍液态，一次冻融指室温回温再回冻。实测第5次冻融后ELISA效价掉15%，第7次掉30%。把分装管插进PCR冰盒分批取用，升温时间压到3 min以内，减少一次算一次。年用量>30 mL的实验室直接买50 μL×10支装，比1 mL整瓶更抗冻融。

4 ℃存放隐形杀手

很多人把HRP二抗放4 ℃抽屉超过8周，背景开始飘。微量细菌分泌蛋白酶会切Fc段，效价每周掉3%。每两周用0.22 μm滤头压滤一次，能延长到10周不变质。加0.02% NaN?可抑菌，NaN?会抑制HRP，ECL信号掉20%，只能二选一。荧光版最怕湿度，4 ℃存放八周亮度剩95%，十二周跌到85%，长期请直接-80 ℃。

酶活急救Pulse法

HRP信号突然衰减，可试0.3% H?O? pulse 30 s，PBS冲洗后进ECL，酶活回弹10–15%。原理是低浓度过氧化物把HRP的Fe3? inactive重新氧化成Fe2? active，pulse超过60 s会直接失活，需要秒表计时。救回来也写进实验记录，避免审稿人追问“为什么条带时强时弱”。

污染识别与切除

原液出现絮状沉淀，10000 ×g离心10 min，取上清测效价。效价无变化说明只是变性蛋白聚集，丢弃沉淀即可；效价同步下降代表整批已聚合，继续用会把背景抬高一个数量级，直接整管报废，别心疼。荧光版出现雾状浑浊，0.22 μm滤膜压滤后亮度可拉回90%，再浑浊就停用。

设备联动校准

每次做ECL前，用旧批号A21110跑系统适用性：0.5 ng小鼠IgG必须出条带，灰度值0.8–1.2 AU。新批号再跑一遍，偏差>15%说明保存或运输出问题，立即启动退换流程，避免整批数据漂移。流式细胞仪同理，用标准微球+小鼠IgG包被，阳性群MFU值应落在2.4×10?±10%，超差就停实验。

成本控制小技巧

年度需求>50 mL的实验室，与供应商签分批发货协议，每月到一瓶新鲜批号，减少单次囤货。原液浓度1 mg/mL够用，不必选2 mg/mL高浓度版，高浓度在冻融时聚合速度更快，实际用下来更浪费。国产分装版先跑一批效价标定，数据稳定再锁原装，能省30%预算。