免疫原设计把交叉锁死

A21090 用猪血清IgG 全分子+猪IgG1/IgG2/IgG3 亲和片段混合免疫山羊，免疫前先把猪IgA、IgM 做免疫吸附，降低非IgG 干扰。血清先过Protein G 粗提，再过猪IgG 专属层析柱，最终抗体对猪IgG 重链Fc 段 CH2–CH3 环识别，表位线性序列 335–347 aa（DKTHTCPPCPAGK），同源性比对显示与牛、羊、人同源度 ≤68%，交叉OD450 读值 ≤0.02，做多物种组织芯片时可直接上场。

亲和力动力学一览

BLI 实测 KD 1.1 nM，Kon 1.4×10? M?1s?1，Koff 1.5×10?? s?1，慢解离让抗体在WB 多次洗膜后依旧挂得住；流式高抗原密度下，10 min 孵育即可饱和，缩短实验周期。做猪源病毒中和实验，0.5 μg/mL 一抗+ A21090 1:400 稀释，阳性细胞群MFU 值稳定在2.4×10?，阴性群MFU 1.3×102，信噪比180，足以自动设门。

标记酶催化路径

HRP 标记版每个抗体偶联 3–4 个酶分子，采用过碘酸钠氧化糖链定向法，酶活保留率 ≥95%。ECL 反应时，HRP 激活鲁米诺产生 425 nm 蓝光，0.2 pg 猪IgG 在PVDF 膜上检出，条带灰度 0.8 AU，曝光 30 s 不饱和。酶活 4 ℃ 六周损失 <8%，比随机赖氨酸偶联法少损失一半，适合做长程动力学定量。

荧光染料能量转移

Alexa Fluor 555 标记 A21090 D/P 值 3–5，激发 555 nm，发射 565 nm，与PE 间距 10 nm，光谱重叠系数 0.12，补偿值 5%，远优于Cy3。做双光子成像，760 nm 激发，发射 580–610 nm 区间收集，猪肺组织切片中胶原自发荧光 450–550 nm，通道互不干扰，信号背景比 60:1。

信号放大级联

PLA 邻近连接实验里，A21090 作为桥梁二抗，一端认猪一抗，另一端带 DNA 短链，两抗体相距 <40 nm 时连接酶环化，滚环扩增后荧光探针杂交，单分子亮点放大 800 倍，0.3 pM 猪IgG 仍可被显微镜捕获，实现病毒抗原-宿主蛋白互作单分子可视化。

干扰源与阻断方案

猪血清高浓度 IgG 会竞争结合 A21090，造成背景。封闭液里加入 2% 猪血清预吸附 30 min，游离 IgG 降到 0.4 μg/mL，背景 OD 从 0.18 压到 0.02。组织切片 Fc 受体丰富，用 F(ab')? 片段版 A21090，去掉 Fc 段，不再与 FcR 结合，猪脾脏组织背景荧光下降 65%。

实验流程一分钟速图

1. 封闭：5% BSA 1 h
2. 一抗：猪源 1 μg/mL 过夜
3. 洗膜：PBST 3×5 min
4. 二抗：A21090 HRP 1:20000 1 h
5. 洗膜：PBST 4×7 min
6. ECL：1 min 曝光 30 s
7. 定量：灰度值 0.1–1.0 AU 线性