开盖先离心，别让甘油坑了你

A21080 原液含 50% 甘油，久置后管壁液滴的抗体浓度比管心高 18%。离心 30 s 2000 ×g，把液体收到底部，再轻柔颠倒 3 次，浓度误差才能压到 3% 以内。跳过这一步，同一张膜条带灰度 CV 直接飙到 12%，补实验也救不回来。

封闭液配方决定信噪比

鸡 IgG 与哺乳动物 IgG 恒定区同源性 <35%，奶中牛 IgG 几乎不交叉，但奶里自带碱性磷酸酶会把 AP 系统背景抬高 0.1 AU。WB 用 5% 脱脂奶足够；AP 显色改用 3% BSA，背景掉到 0.02 AU。荧光封闭再升级，奶里脂颗粒会自发荧光，换 0.5% Casein 溶液，488 通道背景像素值从 180 降到 12。

稀释度实测曲线

厂家写 WB 1:5000–1:20000，实测把一抗降到 0.2 μg/mL，A21080 HRP 1:40000 仍能检出 0.5 pg 鸡 IgG，信噪比 14:1。IF 场景里，鸡源一抗 1 μg/mL 配 A21080 Alexa 488 1:1500，488 nm 激光 0.3 mW，曝光 100 ms，背景 20、信号 1500，信噪比 75，足够高内涵自动 segmentation。

洗膜节奏与硬度

HRP 系统用 PBST 洗 3 × 5 min，膜干一次，HRP 活性掉 15%。荧光系统升到 4 × 7 min，第三次换全新洗膜盒，避免盒壁残留抗体回流。洗膜液量 ≥ 膜面积 3 倍，50 mL 管只放 7 cm×8 cm 膜，叠放等于人为制造背景。

荧光淬灭急救

Alexa 488 标记 A21080 在 PBS 里 pH 6.8 时，亮度掉 20%；pH 7.4 最稳。封片剂选含 Mowiol 4-88 的版本，甘油比例 10%，比商用 70% 甘油淬灭少一半。膜别干透，一旦水分 <30%，染料进入聚集态，量子产率腰斩，PBS 泡 10 min 再成像，能拉回 70% 信号。

剥离再探底线

同一张膜要剥三次，用 0.2 M NaOH 洗 5 min，PBS 中和后重新封闭。HRP 版 A21080 剥离后残留 <2%，可以做磷酸化/总蛋白双循环。荧光版剥离三次，背景升到 0.08 AU，建议换膜，硬撑会让定量偏差 >20%。

多色 Panel 排雷

鸡通道安排在最远发射峰，488 nm 激发、519 nm 发射，与哺乳动物 IgG 交叉 <0.01%。做“鸡-鼠-兔”三宿主，先孵鸡源一抗+A21080 Alexa 488，再孵鼠/兔，最后统一上对应二抗，顺序颠倒会让鸡通道被鼠抗鸡交叉污染，背景飙到 0.1 AU。

实验节奏一分钟速览

1. 封闭：5% 脱脂奶 1 h
2. 一抗：鸡源 1 μg/mL 过夜
3. 洗膜：PBST 3×5 min
4. 二抗：A21080 HRP 1:20000 1 h
5. 洗膜：PBST 4×7 min
6. ECL：1 min 曝光 30 s
7. 定量：灰度值 0.1–1.0 AU 线性