收货当天必须做的体检

原瓶抵达后立刻放4 ℃缓霜，避免甘油局部结晶。离心1 min 2000 ×g，把管壁液滴收到底部，测OD280 乘1.4 估算浓度，误差>10% 直接退货。HRP 版本顺手测RZ=A403/A280，<0.4 说明酶失活过半，ECL 信号会提前衰竭。

分装体积算到微升

每管一次实验用量+10% 富余，50 μL 是WB 常用临界点，低于30 μL 蒸发量占比陡升。用0.5 mL 低蛋白吸附管，管底锥形设计减少死角。荧光标记版避光铝箔纸包两层，贴标签写日期和批号，避免-80 ℃ 结霜后字迹消失。

冻融循环硬上限

A21050 原液含50% 甘油，-20 ℃ 仍保持液态，冻融一次指从-20 ℃ 升到室温再回冻。实测数据显示第5 次冻融后ELISA 效价掉15%，第7 次掉30%。把分装管插进PCR 冰盒里分批取用，能把升温时间压到3 min，减少一次算一次。

4 ℃存放隐形杀手

很多人把HRP 二抗放4 ℃ 抽屉超过两个月，背景开始飘。原因是微量细菌分泌蛋白酶，切割抗体Fc 段。每两周用0.22 μm 滤头压滤一次，能延长到8 周不变质。加0.02% NaN? 可抑菌，但NaN? 会抑制HRP 活性，ECL 信号掉20%，只能选其一。

荧光染料褪色曲线

Alexa Fluor 488 标记A21050 在4 ℃ 避光六周，亮度剩95%，八周跌到85%，十二周只剩70%。-80 ℃ 存放一年亮度维持92%，但冻融三次后跌到78%。真的要用老批号，把浓度提高30% 补偿亮度，别直接延长曝光时间，背景会一起涨。

酶活挽救急救法

HRP 信号突然变弱，可试1 mg/mL 过氧化氢 pulse 30 s，再进ECL，酶活能回弹10–15%。原理是低浓度过氧化物把HRP 的Fe3? inactive 形式重新氧化成Fe2? active 形式，pulse 时间超过60 s 会直接失活，需要秒表计时。

污染识别与切除

原液出现絮状沉淀，10000 ×g 离心10 min，取上清测效价。若效价无变化，沉淀为变性蛋白，丢弃沉淀即可；若效价同步下降，说明整批已经聚合，继续用会把背景抬高一个数量级，直接整管报废，别心疼。

设备校准联动保养

每次做ECL 前，用旧批号A21050 跑系统适用性：0.5 ng 人IgG 必须出条带，灰度值落在既定区间 0.8–1.2 AU。出新批号再跑一遍，偏差>15% 说明保存或运输出问题，立即启动退换流程，避免整批实验数据漂移。

成本控制小技巧

年度需求>50 mL 的实验室，与供应商签分批发货协议，每月到一瓶新鲜批号，减少单次囤货。原液浓度 1 mg/mL 够用，不要选 2 mg/mL 高浓度版，高浓度在冻融时聚合速度更快，实际用下来更浪费。