免疫原设计决定特异性

A21040 采用完整大鼠IgG 分子（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c 混合）对山羊进行多点超免疫。血清先经Protein G 粗提，再流过大鼠IgG 预吸附柱，把可能交叉的小鼠、兔、人IgG 全部拉掉。最终得到的抗体用ELISA 检测，对大鼠IgG 各亚型识别斜率一致，与小鼠IgG 交叉OD450 ＜0.02，保证WB、IF、FC 场景里不会误抓非目标条带或细胞群。

表位识别区域解析

胃蛋白酶水解+肽谱 mapping 显示，A21040 主要识别大鼠IgG Fc 段 CH2–CH3 交界，表位线性序列为 332–342 aa（EDKTHTCPPCP）。该段在所有大鼠亚型保守度 100%，但在小鼠、仓鼠、豚鼠序列里分别存在 3–4 个氨基酸替换，解释为何交叉低至 0.1%。做突变体验证时，把大鼠IgG 该段 337 位 T 换成 A，抗体结合力下降 85%，可作为阴性对照。

亲和力与解离常数

BLI 实测 KD 1.2 nM，Kon 1.1×10? M?1s?1，Koff 1.3×10?? s?1，属于高亲和、慢解离组合。WB 场景里，PVDF 膜上抗原密度低，慢解离让抗体在多次洗膜后依旧保留信号；流式细胞仪里高抗原密度，快结合优势让 10 min 孵育就能达到饱和，缩短实验流程。

标记酶催化路径

HRP 标记版 A21040 每个抗体分子偶联 3–4 个 HRP，采用过碘酸钠氧化+硼氢化钠还原法，糖链开环后酶与Fc 区定向连接。ECL 反应时，HRP 在 428 nm 处激活鲁米诺，产生 425 nm 蓝光，量子产率 0.02，膜上 0.1 pg 大鼠IgG 可检出。酶活保留率 ≥95%，4 ℃ 存放 6 周活性损失 <8%，比随机赖氨酸偶联法少损失一半。

荧光染料能量转移

Alexa Fluor 488 标记 A21040 的 D/P 值 3–4，激发 495 nm，发射 519 nm，斯托克斯位移 24 nm，减少激发光渗漏。多色 Panel 里与 Alexa 555 同拍，光谱重叠系数 0.09，只需补偿 3.2%，比 FITC/PE 组合少 70% 串扰。做全细胞成像时，488 通道激光功率 0.5 mW，曝光 100 ms，背景像素强度 12，信号像素 1800，信噪比 150，可直接用于高内涵定量。

信号放大级联策略

PLA（邻近连接实验）场景里，A21040 作为“桥梁”二抗，一端认大鼠一抗，另一端带 DNA 短链。两抗体相距 <40 nm 时，DNA 短链被连接酶环化，滚环扩增后荧光探针杂交，单分子亮度提升 800 倍。0.3 pM 大鼠IgG 仍可被显微镜抓到亮点，实现蛋白互作单分子级别可视化。

常见干扰与阻断方案

大鼠血清里高浓度 IgG 会竞争结合 A21040，造成背景。封闭液里加入 2% 大鼠血清预吸附 30 min，可把游离 IgG 降到 0.5 μg/mL，背景 OD 从 0.15 压到 0.02。组织切片里 Fc 受体丰富，用 1:100 稀释的 F(ab')? 片段版 A21040，去掉 Fc 段，不再与FcR 结合，肾组织切片背景荧光下降 60%。

实验流程一分钟速图

1. 封闭：5% BSA 1 h
2. 一抗：大鼠源 1 μg/mL 过夜
3. 洗膜：PBST 3×5 min
4. 二抗：A21040 HRP 1:20000 1 h
5. 洗膜：PBST 4×7 min
6. ECL：1 min 曝光 30 s
7. 定量：灰度值线性区 0.1–1.0 AU