1. 命名厘清：ATF、ATF1、ATF2 谁是蛋白谁是基因

官方符号 ATF1 与 ATF2 属于转录激活因子家族，文献偶尔把“Astrocyte-Derived Trophic Factor”缩写为 ATF，容易混淆。细胞培养语境下，ATF 通常指胶质细胞来源的神经营养活性上清。订购前先看货号后缀：若带-GDNF 表示含 Glial Derived Neurotrophic Factor 重组蛋白，与转录因子无关，避免买错。

2. 储存解冻：-80 ℃ 到 37 ℃ 的 90 秒法则

重组 ATF 冻干粉含 0.2% HSA 保护剂，-80 ℃ 保存 24 个月稳定。解冻时 37 ℃ 水浴 90 秒，剩余冰晶直径 <2 mm 立即离水，防止长时间高温造成蛋白聚集。解冻后轻轻颠倒 5 次，禁止涡旋，气泡剪切力会让活性下降 18%。

3. 溶解体积：一次稀释到工作浓度

厂家建议用 1 mL 无菌 PBS 复溶，浓度 100 μg/mL。直接溶成高浓储液，减少多次稀释带来的污染风险。储液分装 50 μL/管，-80 ℃ 存 6 个月，单次用完，杜绝反复冻融。实验前用基础培养基稀释到 50 ng/mL，加入 0.1% BSA 防止管壁吸附。

4. 包被培养皿：Poly-L-lysine + ATF 双包被

神经细胞贴壁弱，先用 0.1 mg/mL Poly-L-lysine 37 ℃ 包被 1 h，PBS 洗 1 次，再按 2 μg/cm2 ATF 4 ℃ 过夜。双包被使轴突长度提升 1.4 倍，单用 PLL 效果不显著。包被液回收后可 4 ℃ 保存 3 天，用于同批次实验，减少成本。

5. 细胞密度：每 cm2 1.5×10? 个最省因子

原代大鼠皮层神经元密度 <1×10?/cm2 时，轴突网络稀疏；>2×10?/cm2 出现接触抑制。1.5×10?/cm2 能在 48 h 形成突触，ATF 消耗量最少。96 孔板每孔加 100 μL 悬液，总量 1.5×10? 个细胞，节省 30% 营养因子。

6. 换液节奏：半量换液防剪切

神经元对剪切力敏感，全量换液导致突触回缩。采用半量换液，每 48 h 替换 50% 体积，含 25 ng/mL ATF 维持浓度。换液前新培养基 37 ℃ 预温，枪头贴壁缓慢加入，液面不泛起涟漪，轴突保留率提升 22%。

7. 活性验证：轴突长度与磷酸化 Akt 双重读数

培养 72 h 后 ImageJ 量轴突长度，ATF 组平均 120 μm，对照 85 μm。Western 测 p-Akt Ser473，ATF 组信号增强 1.8 倍，抑制剂 LY294002 可逆转，证明 PI3K 依赖通路。两个指标同时阳性，才能认定 ATF 功能正常。

8. 污染排查：支原体啃掉神经营养效果

支原体阳性时，即使 100 ng/mL ATF 也救不了轴突萎缩。每月做一次 PCR 抽检，引物针对 16S rRNA，灵敏度 10 copies。发现污染，立刻丢弃细胞，培养箱 37 ℃ 空转 24 h，0.1% 过氧乙酸擦拭内壁，防止交叉。

9. 废液处理：活性蛋白灭活 121 ℃ 30 min

ATF 属于生物活性蛋白，直接倒入下水存在生物安全风险。废液收集后 121 ℃ 高压 30 min，蛋白彻底变性，OD280 下降 90%，再按普通化学废液处理，符合实验室 EHS 要求。

10. 记录归档：电子模板锁定关键参数

把包被浓度、细胞密度、换液时间、轴突长度、p-Akt 灰度全部录入 Google Sheet，设置数据验证，OD 值超出 0.2–2.0 范围自动标红。历史数据可追溯，换新人也能无缝接手，减少培训成本。