1. 名称迷宫：一次说清 CLG4、MONA、TBE-1 到底指谁

官方基因符号 MMP2 编码蛋白 Matrix Metalloproteinase-2，实验室口语简称 Gelatinase A。CLG4 与 CLG4A 是早期克隆编号，MONA、TBE-1 来自不同课题组首次测序时随意命名的 cDNA，文献里偶尔回潮。抗体说明书若写 Anti-TBE-1，先核对 UniProt 登录号 P08253，避免把 MMP-9 抗体错当成 MMP-2。

2. 样本类型选择：血清、细胞上清还是组织匀浆

血清含内源性 MMP-2 主要以无活性的 pro-form 存在，测活性需先加入 APMA 进行体外激活。细胞上清里 MMP-2 活性与侵袭表型直接相关，适合药效评价。组织匀浆要注意：液氮研磨后立刻用 1% Triton X-114 相分离，去除膜结合型 MMP-2，否则后续条带拖尾。

3. 明胶酶谱法：仍是活性金标准

配制 8% SDS-PAGE 时加入 1 mg/mL 明胶，电泳完成后 2.5% Triton X-100 洗 2×30 min，把 SDS 去掉。孵育缓冲液 pH 7.5，加 5 mM CaCl? 与 1 μM ZnCl?，37 ℃ 静置 20 h。考马斯亮蓝 R-250 染色 1 h，脱色到深蓝背景出现 72 kDa 白透明条带。条带灰度与活性成正比，线性范围 5–120 ng，灵敏度足以检测 1×10? 个黑色素瘤细胞的分泌量。

4. 荧光底物动力学：高通量药物筛选

MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH? 底物在 37 ℃ 被活性 MMP-2 切断，释放荧光 393/472 nm。96 孔板体系 100 μL，酶终浓度 50 ng/mL，底物 10 μM。反应启动后连续读板 10 min，斜率即酶活。抑制剂 IC?? 曲线用 10 点三倍稀释，Z? 因子 0.78 视为合格。注意 DMSO 终浓度 ≤1%，否则出现假阳性。

5. 避免假阴性：金属离子平衡

EDTA 痕量残留就能把活性降到零。玻璃器皿用 10 mM HCl 浸泡一夜，再用去离子水冲三遍。缓冲液现加 Ca2?、Zn2?，放置超过 6 h 重新配制。实验室老式金属水浴锅常含 Fe3?，用塑料槽代替，防止离子串扰。

6. 定量校准：活性单位与蛋白质量脱钩

商业重组人 MMP-2 活性批次差异大，别用 ng 当横坐标。用已知比活 1200 U/mg 的参考品做梯度，绘制 U/mL-荧光斜率标准曲线。每次实验带两点校准，偏差 >8% 即重跑。发文章时把“活性单位”写进方法，审稿人不再追问。

7. 抑制剂验证：GM6001 浓度窗口

GM6001 对 MMP-2 Ki ≈ 0.4 nM，实际工作浓度 2.5 μM 可完全抑制。预实验做 0–10 μM 梯度，确认 72 kDa 白带消失即可。别一口气加到 25 μM，容易脱靶抑制 MMP-9，导致数据解释混乱。

8. 时间梯度：别错过前体激活峰

APMA 激活 pro-MMP-2 呈时间依赖，1 mM APMA 37 ℃ 处理 0–120 min，每 15 min 取样。Western 用抗催化域抗体，可见 72 kDa 条带逐渐下移 2 kDa，代表前肽切除。活性检测同步进行，20–30 min 达峰值，过度激活反而自降解，信号下降。

9. 双酶共显：MMP-2 与 MMP-9 同板区分

酶谱胶里 92 kDa 位置常出现 MMP-9 条带。用 MMP-9 中和抗体 2 μg/mL 预先孵育样本 1 h，92 kDa 白带消失，72 kDa 不受影响，即可确认身份。荧光法直接选 MCA-PLGL-Dpa-AR，该序列 MMP-2 kcat/Km 比 MMP-9 高 6 倍，交叉干扰 <5%。

10. 数据报告：把灰度换成活性单位

酶谱胶拍照后用 ImageJ 量灰度，先转换成“相对活性”，再乘以当日校准曲线斜率，得到 U/mL。审稿人常问“为何不用 Western 定量”，回答“Western 测的是蛋白量，非活性”即可过关。附原始胶图时标注白框，防止被质疑裁剪。