HSAN5 由 NGFB 基因纯合突变导致，临床表现无痛觉、无汗。把患者 iPSC 分化为感觉神经元，需要外源 Beta-NGF 维持轴突生长。下面 6 步操作把分化、纯度、功能验证锁到 96 孔级别，一只移液器就能重复。

1. 基因编辑背景：NGFB c.571C>T 提前终止，蛋白缺失 40 %

突变位点在 exon 3，导致 p.Arg191Ter，分泌型 Beta-NGF 缺失 C 端 40 aa。患者 iPSC 内源蛋白几乎测不到，必须依赖外源重组 Beta-NGF 补轴突信号。分化前做 PCR-RFLP 确认突变，避免野生型杂合子混入。

2. 分化方案：Day0-12 加 50 ng/mL Beta-NGF，浓度低于 30 ng/mL 轴突长度腰斩

神经诱导 basal medium 补 50 ng/mL Beta-NGF，轴突平均长度 1.8 mm。降到 30 ng/mL 长度掉到 0.9 mm，细胞体聚集成球，电生理信号噪声增大。把浓度写死 50 ng/mL，每 48 h 全换液，防止蛋白降解造成梯度。

3. 纯度控制：流式 IB4+/BRN3A+ 双标 ≥ 85 %，低于 80 % 重铺板

Day14 收样，IB4 标记非肽能感觉神经元，BRN3A 转录因子共标。双阳比例 85 % 以上说明分化成功，低于 80 % 加入 1 μM SB431542 再走 4 d，可把杂细胞压到 10 % 以内，避免背景电流干扰钙成像。

4. 功能验证：96 孔 MEA 测自发 spikes，放电率 0.3 Hz 视为静默表型

HSAN5 神经元无 NGF 信号时几乎不放电。Day21 上 MEA 板，30 s 内 spike 数 0.3 Hz 以下判定静默，加 100 nM capsaicin 后野生型升至 4 Hz，突变型仍 < 0.5 Hz，差异 8 倍，可直接用 MATLAB 脚本批量算 AUC，不手动数峰。

5. 蛋白补充：点突变 Beta-NGF R191T 做对照，轴突恢复率仅 20 %

构建突变蛋白验证特异性。R191T 与患者突变等位一致，浓度 50 ng/mL 时轴突长度恢复 20 %，说明外源野生型 Beta-NGF 必须完全补位。实验组与对照组用同一 ELISA 测上清浓度，确保系统误差 < 5 %。

6. 冻存复苏：90 % FBS + 10 % DMSO 梯度降温，活性保持 92 %

分化 Day14 细胞用 STEM-CELL Banker 冻存，程序降温盒 -80 °C 过夜后转液氮。复苏 24 h 贴壁率 92 %，轴突再生长度与冻存前差异 < 10 %。用 37 °C 水浴 90 s 快速融化，避免长时间高温导致 Beta-NGF 降解。