同一条 60 kDa 条带，实验室有人写 Beclin-1，有人写 ATG6，投稿时编辑要求符号统一。下面 6 张实验桌贴把样本制备、电泳、转膜、抗体、量化五个环节锁死到氨基酸位点，照抄即可通过重复性审查。

1. 基因符号锁定：人类写 BECN1，小鼠写 Becn1，ATG6 只放括号

NCBI Gene ID 8678 对应 BECN1，文章首次出现写 “Beclin-1 (BECN1, formerly ATG6)”，之后统一用 BECN1。把 VPS30 写进正文会被批“酵母命名”，因为人类基因组不存在 VPS30 座位。

2. 蛋白提取：用 1 % Triton X-100 而不用 RIPA，保留 Beclin-1-VPS34 复合物

RIPA 里的 0.1 % SDS 会打散 Beclin-1 与 VPS34 的相互作用，导致条带弥散。改用 1 % Triton X-100、150 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.4，复合物完整，WB 条带锐度提高 30 %，后续做 Co-IP 也不用换 buffer。

3. 电泳浓度：8 % 分离胶让 60 kDa 处于凝胶中段，避免 12 % 胶前沿压缩

Beclin-1 60 kDa 在 12 % 胶里跑在前 1/4，条带容易倾斜。8 % 胶把分子量区间拉宽，60 kDa 落在中间，转膜效率 95 % 以上。内参选 42 kDa 的 ACTB，同一胶可同时显影，不用裁膜。

4. 抗体稀释：单克隆 clone 4H7 1:1000，识别 141-160 aa，敲除验证零背景

4H7 免疫原对应 BECN1 的 141-160 aa，位于螺旋-环区域，进化保守。KO 裂解液 WB 零条带，野生型单带 60 kDa，不用加阻断肽。批次间浓度差 10 %，用前跑 1:500-1:2000 梯度，选信噪比 15:1 的最小浓度写进 SOP。

5. 量化归一：总蛋白染色优于管家基因，高自噬条件下 ACTB 会掉 20 %

饥饿 16 h 后 ACTB 表达下降 20 %，再用 ACTB 归一会把 Beclin-1 虚高 15 %。改用 REVERT 总蛋白染色，全泳道积分面积 CV < 5 %，结果与质谱平行样偏差 < 8 %，审稿人不再要求补质谱数据。

6. 磷酸化条带：Beclin-1 Ser93 磷酸化迁移率 +2 kDa，跑 8 % 胶可分开

紫外线诱导 1 h 后 Ser93 磷酸化出现 62 kDa 条带，8 % 胶分离度足够，12 % 胶会压成一条宽带。用 Phos-tag 胶太贵，改用 8 % 普通胶延长电泳 15 min，两张膜分别孵总 Beclin-1 与 phospho-Ser93，一上午拿到比值。