同一管标着 Immunoglobulin G2B、IgG2b 的小鼠腹水，有人能拉出 150 kDa 锋利主带，有人还原胶里 55 kDa 位置总拖一条 50 kDa 影子。问题不在手艺，在没把酶切位点和二硫重排机理吃透。下文把 IgG2b 从铰链水解到 Fc 重折叠的 5 个关键节点拆开，给出每步可验证的抓手，照图施工，杂带直接消失。

1. 铰链区架构：Papain 切点裸露 3 h 就被剪崩

小鼠 IgG2b 铰链区比 IgG1 少 5 个氨基酸，223–232 段只有 9 残基，Papain 切点 Pro227 暴露在外。

• 参数：37 °C、酶/底物 1:20，5 min 内可切出 Fab 38 kDa + Fc 28 kDa；时间拖到 30 min，Fc 被二次剪成 20 kDa 碎片。
• 控制：反应 10 min 立即加 20 mM IAA 灭活，SDS 胶里 28 kDa 条带面积 ≥ 95 %，出现 20 kDa 即判超时。

2. 二硫配对：Cys232 游离 5 % 就能产生 75 kDa 二聚

非还原条件 IgG2b 应只出现 150 kDa 单带。铰链区 C232 若未完全配对，会拉出 75 kDa 肩峰。

• 验证：非还原 CE-SDS，75 kDa 面积 < 1 %。
• 出现 3 % 肩峰，把样品 4 °C 过夜透析到 50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM GSH，再回加 0.2 mM GSSG 氧化 2 h，肩峰可压到 0.5 %。

3. 糖基化占位：N297 高甘露糖型 > 30 % 会假性增强 CDC

小鼠 IgG2b 只有 CH2–N297 一个位点，高甘露糖型比例升高会提高 C1q 结合。

• 参数：MALDI-TOF 糖肽，Man5 占比 20–30 %，复杂型 60–70 %。
• 若 Man5 > 40 %，说明表达时甘露糖苷酶 I 活性不足，要求厂家改用 30 °C 低温培养，能把 Man5 压回 25 %。

4. 金属蛋白酶污染：28 kDa Fc 被剪成 26 kDa

腹水里若含金属蛋白酶，Fc 区 Gly253 被剪，还原胶里 55 kDa 重链出现 50 kDa 影子。

• 验证：还原 CE-SDS，50 kDa 面积 < 2 %。
• 出现 5 % 影子，加 1 mM EDTA 4 °C 过夜可阻止继续剪切；再纯化时用 20 mM 柠檬酸钠 pH 6.0 洗脱，能把金属酶留在流穿。

5. Fc 重折叠：CH2 结构域 Tm 64 °C，超 60 °C 就塌

差示扫描量热法显示，IgG2b Fc Tm 64 °C，比 IgG1 低 3 °C。

• 工艺限制：蛋白 A 洗脱时最高 55 °C，超 60 °C 会出现 28 kDa 非还原条带。
• 监控：洗脱液立即冰浴，SEC 检测 28 kDa 面积 < 0.5 %；超标就把洗脱 pH 从 3.0 调到 3.5，温度降到 50 °C，回收率只降 5 %，聚集体不再出现。