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IGHG2 稳转老是崩?技术参数一次钉死 7 个锚点
2025-10-17
同一管标着 IGHG2、Ig Gamma-2 Chain C Region、Immunoglobulin Heavy Constant Gamma 2、G2m Marker、Immunoglobulin Gm2 的重组序列,有人能在 CHO-K1 里推到 5 g/L,有人 48 h 就只剩 1 g/L 还伴随 30 % 聚集体。差距不在细胞系,在有没有把技术参数写成可签字的出厂标准。下文给出决定 IGHG2 能否高表达、高活性、低聚集的 7 组硬数字,每一条都附带当场能做的验证方法,照单验收,项目周期直接砍 3 周。
1. 序列坐标:EU 索引 99–327 必须零突变
恒定区 EU 编号 99–327 对应 CH1–CH3,任何点突变都会改变 G2m(n) 抗原表位。
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行业红线:Arg214、Phe221、Tyr296 三位是 G2m 标记核心,出现 His214 变异即失去 G2m2 血清分型价值。
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验收:让供应商提供 Sanger 测序 chromatogram,三位置信峰值高度 ≥ 95 %,否则整批退货。
2. 糖谱比例:Fuc 100 %、G2F 70 %、 afucosyl < 6 %
IGHG2 的 ADCC 天然比 IGHG1 弱,但核心岩藻糖一旦低于 94 %,活性反而飙升 8 倍,与临床历史数据冲突。
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参数:LC-MS 糖肽法,Fuc 占比 94–100 %,G2F 70 ± 5 %, afucosyl < 6 %。
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现场抽检:5 μg 还原烷基化后用 HILIC-UPLC 跑 25 min,afucosyl 峰面积 > 6 % 即判批间漂移,要求厂家换下一批。
3. 二硫拓扑:铰链区四链必须全配对
IGHG2 铰链区比 IGHG1 多一对 Cys232–Cys233,任何错配都会产生 75 kDa 肩峰。
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非还原 CE-SDS 参数:主带 150 kDa 面积 ≥ 97 %,75 kDa 肩峰 < 1 %。
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出现 75 kDa 信号说明复性温度 > 28 °C,要求厂家把复性罐温降到 20 °C 并重交。
4. 聚集体:SEC-HPLC 二聚体 < 2 % 且无前峰
Fc 段 CH2–CH3 界面自带疏水补丁,高浓度时容易形成可逆二聚。
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技术参数:SEC-HPLC 0.5 mL/min PBS,主峰 98 %,二聚体 ≤ 2 %,前峰(多聚)0 %。
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实测二聚体 3–5 % 可用 150 mM 精氨酸 + pH 5.5 透析 4 h,再上 Superose 6 精纯,一步回收率 92 %,成本只增 5 %。
5. 内毒素:体内实验 0.05 EU/mg 是硬天花板
IGHG2 等电点 7.5,比 IGHG1 低 0.3 单位,正电荷更少,却仍吸附内毒素。
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动态浊度法:1 mg/mL 样品,阳性 0.25 EU/mL,反应 3600 s 浊度斜率 < 阳性 20 % 算合格。
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超限批次用膜吸附法(Sartorius EndoClear 0.2 μm),一步降到 0.02 EU/mg,回收率 88 %,小鼠休克模型不再出现体温骤降。
6. 纯度平台:还原 CE-SDS 轻链 25 kDa 杂带 < 0.5 %
重链 55 kDa 区若出现 50 kDa 截短,说明信号肽酶识别位点被标签干扰。
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参数:还原 CE-SDS,重链 55 kDa 面积 ≥ 99 %,轻链 25 kDa 面积 ≥ 99 %,截短条带总和 < 0.5 %。
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截短条带 > 1 % 即判为降解批,要求厂家把上游信号肽换成 Igκ leader,重交。
7. 加速稳定性:pH 5.5 蔗糖配方 40 °C 7 天活性保留 ≥ 95 %
运输途中 40 °C 热冲击最常发生。
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配方:20 mM 柠檬酸 + 150 mM NaCl + 5 % 蔗糖,pH 5.5,蛋白 20 mg/mL。
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验证:40 °C 静置 7 天,SEC 主峰下降 ≤ 1 %,活性 ELISA 下降 ≤ 5 %。
不合格批次直接退回,厂家会把缓冲液换成精氨酸-谷氨酸体系,再测一次直到达标。