同一管标着 ACEH、ACE-II、Peptidyl-Dipeptidase A、ACE-related carboxypeptidase、Angiotensin-converting enzyme homolog、Metalloprotease MPROT15 的酶，有人能做出 0.99 的抑制曲线，有人连空白都在飘。问题不在手气，在有没有把反应机理拆成可验证的节点。下文把 ACE-II 从底物结合到产物释放的 5 个关键步骤拆开，给出每一点的质控抓手，照图索骥，数据不再翻车。

1. 活性中心架构：双锌夹心 + Glu389 质子梭

晶体结构显示，ACE-II 在 378 与 389 位各配一个 Zn2?，Glu389 做质子转移梭。

• 第一锌负责极化水分子，第二锌稳定羧氧负离子。
• 任何一批酶若 SDM 突变 Glu389→Gln，kcat 掉 95%，说明表达系统污染了宿主 DNA 聚合酶，直接退货。

2. 底物识别口袋：S1’ 只能容纳 Phe 侧链

天然底物 Ang II 的 Phe? 插进 S1’ 口袋，侧链表面积 120 ?2。

• 合成荧光底物 Mca-APK(Dnp) 时，P1’ 位换 Leu，km 值从 6 μM 飙到 45 μM，信号窗缩 7 倍。
• 实验若发现空白荧光下降速率 > 总反应 5%，说明底物 P1’ 位被酶液中羧肽酶污染，需加 10 μM 卡托普利屏蔽。

3. 催化三步曲：亲核攻击→四面体→产物释放

pH 7.5、25 °C 条件下，速率限制步是四面体中间体崩溃，k3 ≈ 60 s?1。

• 用停流光谱跟踪 Mca-APK(Dnp) 裂解，320 nm 荧光上升曲线双指数拟合，kfast 归属底物结合，kslow 归属产物释放。
• 若 kslow < 40 s?1，说明酶液里存在氧化型亚砜 Met358，活性中心几何扭曲，需换一批新鲜酶。

4. 金属离子交换：Zn2?→Co2? 活性提升 1.4 倍

把活性中心 Zn2? 透析替换成 Co2?，kcat 提升 1.4 倍，km 几乎不变。

• 操作：酶浓度 0.5 mg/mL，加 5 mM CoCl?、50 mM Tris pH 7.5，4 °C 透析 12 h，再换无金属缓冲液透析 6 h。
• 验证：ICP-MS 测 Co/Zn 摩尔比 ≥ 0.95，活性提升 < 1.2 倍说明替换不完全，继续透析 3 h。

5. 抑制剂快照：DX600 的慢结合动力学

DX600 是 ACE-II 专属抑制剂，结合常数 Ki 30 pM，但 kon 仅 1.2×10? M?1s?1，属于慢结合。

• 实验设计：预孵 0–180 min，加酶瞬间读荧光，拟合 kobs vs [I] 得 kon、koff。
• 若 koff 实测 > 2×10?? s?1，说明酶活性中心有 10% 以上处于氧化态，需用 1 mM DTT 预还原 30 min 再测。

6. 反应缓冲液：Cl? 浓度 300 mM 是活性峰值

ACE-II 对离子强度敏感，Cl? 在 300 mM 时 kcat/Km 最大，再高则离子屏蔽降低底物亲和。

• 推荐配方：50 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl、0.01% Tween-20、0.1 mg/mL BSA。
• 实验若用 PBS（Cl? 137 mM），活性掉 25%，IC?? 会右偏 0.2 log，直接误导 SAR 排名。