同一台荧光酶标仪，同一管标着 ACEH、ACE-II、Peptidyl-Dipeptidase A、Metalloprotease MPROT15 的重组酶，有人批间 CV 压到 4%，有人一周跑出三次无效数据。差距不在操作手势，在有没有提前把行业标准拆成可签字的验收单。下文给出决定实验能否被 GLP 采纳的 6 条硬杠杆，每一条都附带实测模板，照单执行，数据可以直接写进申报资料。

1. 催化效率：kcat/Km ≥ 1×10? M?1s?1 才算“真 ACE-II”

行业默认底物 FAPGG（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly）在 340 nm 吸光下降速率换算酶活。

• 合格线：25 °C、pH 7.5 条件下，kcat/Km 值 ≥ 1×10? M?1s?1。
• 现场验收：配制 0.5 mM FAPGG，酶终浓度 5 nM，线性区间 30 s–180 s，R2 必须 ≥ 0.995。

低于这条线，说明活性中心锌配位几何扭曲，整批退货。

2. 纯度门槛：SDS-PAGE 单带 + HPLC 面积归一法双保险

ACE-related carboxypeptidase 的糖基化异构体多，一条 130 kDa 主带旁常拖 110 kDa 碎片。

• SDS-PAGE 还原条件：主带占比 ≥ 95%，无 <70 kDa 降解条带。
• SEC-HPLC：主峰面积 ≥ 97%，二聚体 <3%。

两份图谱日期对齐，缺一即视为不合格。

3. 金属离子残留：Zn2? 含量 1.0–1.2 mol/mol 酶分子

MPROT15 活性中心含 1 个锌离子，ICP-MS 实测值偏差直接影响批间稳定。

• 取样 100 μg 酶，硝酸消解后上机，Zn2? 读数 0.9–1.3 mol/mol 区间算合格。
• 超出上限说明纯化柱金属离子洗脱不彻底，后续做抑制剂筛选会出现 IC?? 左偏 30% 的假阳性。

4. 内毒素：细胞模型实验必须 <0.5 EU/mg

ACE-II 做内皮功能研究时，0.5 EU/mg 是细胞存活率 90% 的拐点。

• 动态浊度法：样品 1 mg/mL，阳性对照 0.25 EU/mL，反应时间 3600 s 内样品管浊度上升斜率 <阳性斜率 50%。
• 超限批次用 Triton X-114 相分离法再除内毒素，回收率 85%，成本增加 10%，数据能救回。

5. 抑制剂验证：卡托普利不抑制、DX600 必须抑制

Peptidyl-Dipeptidase A 家族成员多，用经典抑制剂区分身份。

• 100 μM 卡托普利预孵 15 min，残余活性 ≥ 90%。
• 1 μM DX600 预孵 15 min，残余活性 ≤ 10%。

两步都做，才能写进报告“本批次酶为 ACE-II 而非 ACE-I”。

6. 稳定性测试：37 °C 加速 7 天活性保留 ≥ 85%

申报资料需要强制降解数据。

• 0.1 M Tris-HCl pH 7.5、酶浓度 0.1 mg/mL，37 °C 静置，每天取样测 FAPGG 活性。
• 拟合一阶衰变曲线，t? ≥ 30 天算达标。

低于这条线，-80 °C 运输方案会被发补，要求补充干冰冷链验证。