1. 样本打孔：φ3 mm 圆刃一次切入，边缘挤压会使细胞破裂

干血片纤维厚度 0.5 mm，普通打孔器回拉时会扯断纤维，释放血红蛋白 0.3 AU，抑制后续荧光。改用 3 mm 不锈钢圆刃，单次压切不回抽，溶血率降到 0.05 AU，荧光本底降 12%。把打孔器倒立固定在支架，每次力度一致，CV 从 9% 压到 4%。

2. 萃取缓冲：pH 4.2 柠檬酸 50 mM 激活 GLA 同时抑制旁路酶

溶酶体环境 pH 4.0–4.6，GLA 最适 4.2。用柠檬酸 50 mM + Triton X-100 0.05% 萃取，α-葡萄糖苷酶被酸抑制 80%，GLA 活性保留 95%。pH 调到 5.0，GLA 掉 25%，旁路酶复活，结果假性偏高，新生儿筛查直接误报。

3. 底物浓度：4-MU-α-Gal 1.2 mM 把反应推入零级区

Km 值 0.35 mM，选 1.2 mM 底物，反应速度不再受底物波动影响。低于 0.8 mM，荧光强度随底物批次起伏 15%，复查血片又得重采。把底物分装 1 ml，铝箔避光 -20℃，一次用完，避免反复溶冻造成 4-MU 背景升高。

4. 孵育曲线：37℃ exact 60 min，水浴箱温差 ±0.2℃

GLA 线性区间 0–90 min，60 min 处荧光净增 800 RFU，既避开迟滞期又不过度。水浴箱用 PID 探头，温差 ±0.2℃，孔间荧光 CV<3%。普通培养箱温差 ±1℃，高值样本被“多孵”2 min，RFU 多 30，假性正常导致漏诊。

5. 终止体系：Gly-NaOH 0.4 M pH 10.3 立即淬灭酸

反应到点加 10× Gly-NaOH 0.4 M，pH 10.3，GLA 瞬间失活，4-MU 荧光量子产率升到 0.9。用 PBS 终止，pH 7.4，荧光强度低 20%，还得补校正系数。缓冲液提前分装 1.5 ml 离心管，排枪一步加完，减少手动误差。

6. 校准方程：4-MU 六点梯度 0–400 pmol，RFU 线性 R2>0.998

每板跑六点 4-MU 标准，浓度 0、50、100、200、300、400 pmol，RFU 读数做线性回归，强制过零点，斜率 2.35 RFU/pmol。R2<0.998 整板作废，避免边缘效应把低值样本抬成假阳性。把标准曲线截图附报告，审计时直接通过。

7. 质控血片：打孔位置 5 mm 内，GLA 值 CV<6%

同一干血片分 12 孔，打孔距中心 5 mm 以内，GLA 活性差异 <6%；打到边缘 8 mm，纤维厚度减 20%，GLA 值掉 15%。用定制模板固定打孔位，每批 QC 血片附位置图，确保室间质评样本可追溯，飞检零缺陷。