1. 重链恒定区序列差异：IgG2a与IgG2b只差7个氨基酸，Fc抗体却必须分选

IgG2a（IgHV-I）和IgG2b（IgHV-II）在CH2区存在7个非连续氨基酸替换，导致抗小鼠Fc二抗识别表位偏移。用抗IgG2a单克隆2C11做流式，交叉反应率<0.5%；若误用泛IgG二抗，IgG2b信号会被计入20%。设计panel时把两者当作独立参数，分别配荧光，补偿矩阵才不会崩。

2. 亲和力常数：IgG3对Protein L的KD 10?? M，直接流过也不心疼

Protein L能抓κ链，但IgG3的κ处于低位暴露，KD仅10?? M，上清回收率<30%。纯化IgG3改用Protein A/G混合柱，KD 10?? M，回收率拉到85%。把这一数值写进SOP，避免同组学生反复跑空柱。

3. 铰链区长度：IgA比IgG1长55 ?，FRET pair要留30 nm距离

做κ链FRET，供体放IgA，受体放IgG1，铰链区差55 ?，计算距离时加3 nm缓冲。R?值5.2 nm的CFP-YFP对，距离>8 nm信号掉到基底。把链长写进建模脚本，FRET效率预测误差从35%降到8%。

4. 亚型分子量：IgM五聚体970 kDa，SDS-PAGE还原后仍见185 kDa

非还原电泳IgM在~970 kDa，一条带占整块胶；还原后拆分μ链185 kDa，与IgG重链55 kDa不重叠。跑WB时先用非还原胶筛总IgM，再用还原胶确认μ链，避免把降解条带当成IgG3。把两张图并排投稿，审稿人不再要求补IgM纯度验证。

5. λ链比例：BALB/c血清κ:λ=95:5，捕获抗体别只认κ

小鼠血清λ链仅占5%，厂家常把抗λ抗体做成大包装，单价贵过κ。设计ELISA捕获时，用抗κ抗体包被已能抓95% Ig，λ链留给SPOT检测。把预算投在κ高亲和克隆上，λ抗体买小包装，成本降一半，数据依旧全覆盖。

6. 内毒素限值：腹腔注射用IgG1必须<0.05 EU/mg

体内实验IgG1内毒素0.1 EU/mg足以让小鼠IL-6升300 pg/ml。选GMP级，COA写明<0.05 EU/mg，一批500 mg多花150美元，换来动物数据干净，补测细胞因子费用更贵。

7. 荧光量子产率：IgG2b-Alexa647比IgG1-APC亮18%，互换会导致表达量假性偏低

Alexa647量子产率0.65，APC仅0.55，同样1 μg标记抗体，IgG2b通道MFI高18%。panel里把高表达抗原配IgG1-APC，低表达配IgG2b-Alexa647，能拉平信号，补偿矩阵数值对称，后续降维聚类不再出现人为双峰。