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FGF-1 无血清扩增 iPSC-EC 的技术参数:把 5 ng/ml 做出 95% 纯度

2025-10-15

1. 活性单位换算:ED50 0.15 ng/ml 才是“真香”警戒线

WHO 标准把 FGF acidic 活性定义在 BALB/c 3T3 细胞 ED50 0.15 ng/ml,对应 6.7×10? IU/mg。商品化标签写“100 μg”却不给 ED50,浓度调到 10 ng/ml 细胞还不长,等于买到变性蛋白。下单前让供应商附 COA,ED50>0.5 ng/ml 直接退货,省得把 iPSC 耗成心肌。

2. 糖基化差异:E.coli vs CHO 半衰期差 4 倍

E.coli 来源 FGF-1 无糖基化,37℃ 培养基里 6 h 降解 50%;CHO 表达带 2 个 N-糖位点,半衰期 24 h。做 7 天无血清扩增,CHO 版本用量减到 2 ng/ml 仍能维持 pERK 信号,总成本降 40%。测一次半衰期,把剩余活性画成 37℃ 曲线,再决定买哪种表达系统。

3. 肝素依赖:0.5 IU/ml 低分子肝素让 EC50 下移 3 倍

FGF-1 与 FGFR 结合需肝素做“分子夹板”。无血清培养基里不加肝素,ED50 从 0.15 升至 0.45 ng/ml,细胞提前分化。加 0.5 IU/ml 低分子肝素,EC50 回到理论值,且不会引起下游凝血。把肝素一次性母液 1000× 过滤分装,-20℃ 存 6 个月活性无损失。

4. 稳定剂配方:0.2% HSA 阻断管壁吸附

塑料培养瓶表面带负电,FGF-1 等电点 5.6,在 pH 7.4 培养基里带负电,仍会被疏水区吸附。加入 0.2% 重组人白蛋白,占壁位点,24 h 回收率从 65% 提到 92%。不加 HSA 看似省了钱,多补两次因子,反而把一支 100 μg 小瓶三天用完。

5. 冻融上限:-80℃ 分装 50 μl,五次后活性掉 15%

FGF-1 含 3 个游离巯基,反复冻融形成二聚体,ED50 飘到 0.4 ng/ml。用 PCR 管分装 50 μl/管,一次用完,-80℃ 存一年活性保持 95%。把冻融五次样品跑还原 SDS-PAGE,18 kDa 上方出现 36 kDa 条带,就是二聚体证据,出现即丢弃。

6. 内毒素门槛:<0.01 EU/μg 才能走监管申报

iPSC-EC 要进体内实验,内毒素 0.1 EU/μg 足以让 CD31 阳性率掉 20%。选 GMP 级 FGF-1,COA 写明 <0.01 EU/μg,一批 10 mg 多花 300 美元,换来动物实验一次通过,避免补测鲎试验耽误半年。

7. 反馈检测:pERK 流式 2 h 峰最直

FGF-1 刺激 iPSC-EC,pERK 流式检测 2 h 达峰,Mean Fluorescence Index 增加 8 倍。把 0、5、15、60、120 min 五个点做直方图,峰型锐说明因子活性高;峰型钝,宽拖尾,提示蛋白已氧化或肝素不足。用同批细胞做功能验证,比测 ED50 更快,当天出结果。

8. 溶解缓冲液:PBS+0.1% 海藻糖 pH 7.2 最稳

用纯水溶解,FGF-1 等电点 5.6 会局部沉淀,溶液出现雾状。PBS+0.1% 海藻糖 pH 7.2,渗透压 290 mOsm/kg,蛋白溶解度 15 mg/ml,4℃ 放一周无析出。海藻糖还能在冷冻时形成玻璃态,-20℃ 短期存放不用液氮。