1. 选细胞系：先问细胞里有没有内源 RAGE

CHO-K1 几乎零背景，适合转染；HEK293 高表达 HMGB1，自分泌配体造成基底信号 3×10? RLUs，干扰梯度。用 qPCR 测内源 RAGE mRNA，ΔCt>15 才合格。跳过这步，后续加配体像是在给本来就亮的灯再开开关，数据拉不开差距。

2. 质粒比例：RAGE:pGL4.32:SRE=1:5:0.2 最省 DNA

把全长 RAGE 插 pcDNA3.1，报告基因选 SRE-driven GL4.32，NF-κB 路径一旦激活，荧光素酶线性放大。比例 1:5:0.2 时转染效率 85%，总 DNA 不到 600 ng/24-well，省钱也减少细胞毒性。加大 RAGE 量，膜蛋白过度聚集，基底信号反而抬升 40%。

3. 配体刺激：AGE-BSA 别直接倒，先透析掉游离糖

商品化 AGE-BSA 含 3% 游离葡萄糖，相当于 10 mM 高糖培养基，细胞先渗透压休克，再谈 RAGE 信号。用 3 kDa 透析袋 4℃ 换液 3 次，除去游离糖，刺激曲线 EC50 从 50 μg/ml 降到 12 μg/ml，梯度清晰，省一半配体预算。

4. 发光读板：白色底板＋自动进样器把 CV 压到 4%

黑色板减少孔间串扰，却牺牲 30% 光通量。选白色 96-well 高结合板，配合自动进样器 100 μl/孔 荧光素酶试剂，延迟 1 s 震荡 2 s 再积分 10 s，CV 从 12% 降到 4%。手动加液时间差 5 s，RLUs 误差翻倍，数据被审稿人一句“技术重复不足”打回。

5. 基底校正：用空载体把“非特异发光”抠掉

转染空载体组照样加 AGE-BSA，测得基底 2×103 RLUs。所有实验孔减去该值，再除以 unstimulated 组，得到 fold induction。跳过这步，刺激组 1×10? RLUs 看起来漂亮，其实 20% 来自背景，补实验要再花三天。

6. 时间点扫描：NF-κB 峰值 6 h，拖尾到 24 h 信号掉 35%

RAGE 下游转录后 4 h 开始上浮，6 h 达峰，24 h 回到基线。选 6 h 终止，信噪比 25:1；拖到 24 h 才测，fold 值被代谢拉低，数据像“没刺激”。做时间梯度找峰，再把 n=3 锁定在 6 h，减少孔数也省试剂。

7. 抑制剂验证：Azeliragon 现场“关灯”证明通路特异性

10 μM Azeliragon 预处理 30 min，AGE-BSA 诱导信号从 25-fold 降到 3-fold，把图放在结果第一排，杂志基本不再要求基因敲除验证。抑制剂工作液忌反复冻融，-80℃ 分装 10 μl，一次用完，活性保持 95% 以上。

8. 数据报告：附原始 RLUs 截图，审稿人找不到挑刺入口

除了柱状图，再上传原始酶标仪导出 RLUs 截图，横坐标是孔位，纵坐标是原始发光值。编辑一眼可见技术重复分布，省去“请提供原始数据”往返邮件，返修周期平均缩短 6 天。