1. 胰岛素三维钥匙：B 链 Phe-B24 决定能否插进锁孔

晶体显示受体 L1 结构域与胰岛素 B 链 Phe-B24、B25 形成三明治疏水核，突变 Phe-B24→Ser 让 KD 从 0.05 nM 飙升到 2.1 nM，信号完全丢失。细胞实验选用重组人胰岛素，需核对序列与天然分子 100% 一致，任何标签或点突变都会使体外脂肪生成实验 EC50 右移 3–5 倍。

2. IR 二聚化角度：α-α 距离拉近 7 ? 激活跨膜杠杆

胰岛素结合后两个 α 链外夹角从 120° 缩到 113°，7 ? 的横向位移通过 624-Gly-Gly-625 铰链传递给 β 链，激活 loop 才够位置让 ATP 进入。冷冻电镜捕捉不到这一中间态，用 FRET 探针 IR-mCerulean / IR-mVenus 可实时监测，5 s 内 FRET 效率上升 12%，是通路启动的最早读数。

3. 自磷酸化时序：Y1158 最先，Y1162 决定峰值

质谱时序显示 Y1158 磷酸化出现在刺激后 15 s，Y1162 在 30 s 达峰，Y1163 最慢。单独突变 Y1162→F，Akt 磷酸化峰值下降 80%，常被用作显性阴性对照。做高通量筛选选 30 s 为固定窗口，可避开下游反馈干扰。

4. IRS1 码头效应：pTyr608 为 PI3K 招募创造 SH2 插槽

磷酸化 IR 招募 IRS1，pTyr608 与 PI3K p85 N-SH2 结合 KD 0.9 μM，是传递分水岭。IRS1 丝氨酸 307 磷酸化（mTOR 反馈）会阻断这一界面，使用 100 nM rapamycin 预处理，胰岛素诱导的 Akt-S473 信号增强 1.4 倍，提示反馈解除。

5. PI3K→PDK1→Akt 里程：膜上 5 nm 微区决定速度

PI3K 产生 PIP3 后，PDK1 与 Akt 同时被招募到膜 5 nm 微区，PDK1 T308 位点瞬磷酸化 <5 s。突变 Akt-PH 域 R25C 失去脂结合能力，胞质 PIP3 升高但 Akt 不激活，证明“位置”比“浓度”更重要。高内涵成像用 TIRF 即可实时追踪该微区共定位。

6. GLUT4 囊泡释放：Syntaxin-4 锁定决定融合概率

Akt 磷酸化 AS160，解除对 GLUT4 囊泡的 Rab10 抑制，囊泡沿微管移动。Syntaxin-4 位点突变 M173V 使融合概率从 70% 降到 15%，2-NBDG 摄取下降 60%，常被用于验证葡萄糖摄取特异性。

7. 信号关闭：受体内化 7 min 完成，溶酶体降解占 40%

胰岛素刺激 7 min 后 IR 内化率 60%，其中 40% 走向溶酶体，剩余循环回到膜。氯喹 50 μM 抑制溶酶体酸化，IR 半衰期从 2 h 延长到 6 h，信号延长导致 Akt 持续激活，解释长期高胰岛素血症的脱敏机制。