1. 采血管预冷 4 °C

Insulin 在 25 °C 每小时降解 6%，采血前把 EDTA 管埋冰浴。拒绝肝素，肝素激活磷脂酶，释放 AA 干扰 β 细胞分泌。采完 30 min 内 1 500 g 离心 10 min，血浆分装-80 °C，冻融一次损失 <4%。

2. 柱去脂 20 s

高脂血清浊度 >300 NTU，ELISA 背景 OD 抬高 0.04。取 100 μL 血浆 + 200 μL 甲醇，涡旋 15 s，12 000 g 离心 2 min，上清直接检测，回收率 94%，把脂血干扰压回 ±4%。

3. 标准品复溶节奏

冻干标准用 300 μL 去离子水复溶，室温静置 15 min，轻晃 10 次，避免起泡。复溶后 4 °C 仅稳 6 h，分装 50 μL/管-70 °C 存 28 天，二次冻融偏差 2%，文章里直接写“二次冻融可接受”，审稿人不再追问。

4. 板布局写编号

96 孔板分 3 空白、3 零标准、10 梯度、2 质控，侧边记号笔写日期。每块板自带校准曲线，拒绝共用，能把批间斜率差从 10% 压到 3%。

5. 一步法时间窗

一步法 1 h 孵育，样本 <40 个；两步法 2 h 捕获+1 h 检测，灵敏度从 1.5 μIU/mL 提到 0.3 μIU/mL，适合空腹 2–10 μIU/mL 区间。做胰岛素抵抗研究直接选两步法，能把 HOMA-IR 误差减 0.2。

6. 读数双波长

TMB 显色 15 min 平台，高标浅蓝即可终止。延迟 3 min OD 掉 3%，用 450/630 nm 差减能把漂移拉回 1%。计时器声音开大，一口气完成 96 孔，避免聊天错过终止点。

7. 洗板残液校准

设定 300 μL 注液，抽吸 1 s，残液 ≤2 μL。称空板质量差 ÷96 得平均残液，>3 μL 时用 0.1% 次氯钠浸泡 15 min，再纯水冲洗 5 循环，残液回到 1.5 μL，背景 OD 立降 0.02。

8. 异常值排查

• 空白 OD >0.05：底物污染，换新底物。
• 零标准 OD 低：酶标抗体失活，>30 天，换新。
• 高质控掉值：标准品放置 >6 h，活性降 15%，重开瓶。

9. 废液处理

终止液 2 M 硫酸，用碳酸氢钠中和到 pH 7 再倒。TMB 含 0.01% H?O?，无重金属，直接下水。板子 70% 乙醇泡后当塑料回收，重复利用 CV 翻倍，一次性发文章数据干净。