1. 目标分子画像：脂溶小 steroid 如何被抗体锁死

Testosterone 分子量 288 Da，环戊烷多氢菲骨架无抗原性。

免疫策略：

• 先在 C3 羰基或 C17β 羟基连接 OVA 载体，制成免疫原，小鼠免疫后筛选克隆 2C1，表位覆盖 C3–C4 区域，对 5α-DHT 交叉 3 %，对雄烯二酮交叉 0.8 %，对雌二醇交叉 <0.1 %。

2. 竞争法架构：一孔一抗一抗原的“抢椅子”

微孔板预包被山羊抗小鼠 IgG Fc，形成通用捕捉面。

反应体系：

• 50 μL 样本（或校准品）+ 50 μL 过氧化物酶标记睾酮衍生物（T-HRP）+ 50 μL 单抗，25 ℃ 45 min。
• 游离睾酮与 T-HRP 竞争结合有限抗体位点，游离睾酮越多，最终 OD 越低，标准曲线 4PL 下降型。

3. 酶衍生物合成：C17β 羟基琥珀酰化不破坏 A 环识别

T-HRP 合成步骤：

• 睾酮→琥珀酸酐酯化→活泼酯法与 HRP 赖氨酸 ε-NH? 连接，摩尔比 1∶1，活性保留 92 %。
• 纯化后紫外扫描 403 nm（HRP Soret 带）与 248 nm（睾酮吸收）比值 0.42，批间差异 <5 %，保证竞争曲线重叠。

4. 样本前处理：脂血 + 结合蛋白双重封印

睾酮 98 % 与 SHBG、白蛋白结合，竞争法只测游离部分。

释放策略：

• 稀释液含 0.1 % 吐温-20 + 0.5 % 8-苯胺-1-萘磺酸（ANS），pH 7.4，室温 10 min 把结合型拉到游离侧，回收率 97 %。
• TG > 5 mmol/L 浊度 400 NTU，高速离心 10 000 ×g 10 min 去乳糜，背景 OD 降 0.015。

5. 信号放大：TMB 动力学斜率法取代单点读数

竞争法高值区 OD 0.1–0.2，轻微时差就能让 10 nmol/L 样本掉到 7 nmol/L。

改动力学：

• 加入 TMB 后 37 ℃ 读 650 nm 斜率 5 min，取线性区 Vmax，批内 CV 从 8 % 降到 3 %。
• 提前终止：斜率与硫酸终止法 R2 > 0.99，再切到斜率 routine，省 1 步加酸，废液量减半。

6. 标准曲线：4PL 负斜率+稀释因子双变量

公式：

y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)) + D

A=OD 零孔，D=OD 最大，B=斜率因子 0.8–1.0，C=IC50。

样本稀释 1∶10 已写在曲线里，报告时直接乘 10，避免 Excel 手滑乘错 100。

7. 干扰排除：HAMA 与生物素“双杀”场景

• 类风湿因子 600 IU/mL 把 OD 抬高 0.03，换算假阳性 0.8 nmol/L，加 0.5 % HBR 后回到本底。
• 血清生物素 > 50 ng/mL（美发口服常见）抢占 SA 位点，信号被“中和”，稀释 1∶4 再测，回收率 93 %。

8. 灵敏度与检测限：0.05 nmol/L 是青年男性下限

功能灵敏度 0.05 nmol/L 能把青年男性 8–30 nmol/L 与去势 <1 nmol/L 拉开 2 个数量级；

女性卵泡期 0.5–2 nmol/L，0.1 nmol/L 灵敏度足够，追求再低属于性能冗余。

9. 反应条件：25 ℃ 慢温 vs 37 ℃ 快温

• 37 ℃ 30 min 信号高 12 %，背景也高 0.02，CV 从 4 % 升到 7 %。
• 25 ℃ 60 min，金属浴盖板压顶，蒸发率 < 2 %，整板 CV 压到 3 %，适合多中心比对。

10. 一步法时间轴：45 min 完成 96 孔

样本 50 μL→T-HRP 50 μL→抗体 50 μL，同步加入，减少加样阶梯误差；

洗板 4 次 350 μL PBST，总时长 45 min，急诊实验室 1 h 发报告，比提取+层析法快 3 倍。