1. 目标分子画像：LH 不是单体，是 αβ 异二聚体

LH 由 92 aa 的 α 亚基（与 hCG/FSH/TSH 共用）和 121 aa 的 β 亚基（LHB 基因编码）非共价结合而成。

试剂盒只测 β 链：抗体对锁定 β 亚基 39–52 与 93–105 两段独有表位，避开 α 交叉，FSH 500 mIU/mL、TSH 1000 μIU/mL 干扰 < 0.05 %。

2. 夹心架构：配对抗体如何锚定“活”的 β 亚基

• 捕获抗体：小鼠抗人 LHβ mAb，克隆 125B，IgG1κ，包被浓度 2.5 μg/mL，定向吸附在 96 孔高结合力聚苯乙烯板，4 ℃ 16 h 完成取向排列。
• 检测抗体：生物素化兔抗 LHβ pAb，生物素/Ab 摩尔比 3.2，标记后亲和力下降 < 10 %，保证高剂量端不“钩状”。
• 链霉亲和素-HRP：SA 与生物素 4:1 结合，等效放大 4 个 HRP，信号增益 3.2 倍，TMB 底物 10 min 内 OD 650 可达 2.0。

3. 标准品溯源：WHO 2nd IS 80/552 如何“活”在板孔里

冻干标准品用 0.5 % BSA-PBS 复溶，每批与 2nd IS 平行比对，斜率 0.98–1.02 放行。

稳定性：分装 ?70 ℃ 保存，6 个月内偏差 ≤ 5 %；复溶后 4 ℃ 仅稳 48 h，超期 β 亚基解离，活性下降 7 %。

4. 信号级联：从 HRP 到蓝色产物的一步放大

TMB 底物 A 液含 0.4 g/L 四甲基联苯胺，B 液 0.02 % H?O?，pH 3.8。

反应动力学：

• 25 ℃ 下 Vmax 0.12 OD/s，10 min 进入线性末段，硫酸终止后 450 nm 摩尔吸光系数 59 000 M?1cm?1，1 mIU/mL LH 对应 OD 0.008，仪器 0.001 分辨率足够区分零孔。

5. 背景控制：阻断剂把“空白”压到 0.04 OD

• 板内预封闭 1 % Casein-PBS 1 h，阻断非特异疏水位点。
• 酶结合物稀释液含 0.15 M NaCl + 0.05 % Tween-20，降低静电吸附。
• 实测 40 例 LH < 0.5 mIU/mL 去激素血清，平均 OD 0.038，±2SD 0.045，灵敏度 0.8 mIU/mL 由此算出。

6. 干扰实验：溶血、脂血、生物素怎么破

• 溶血 Hb 1 g/L 使 OD 升高 0.012，换算假阳性 1.5 mIU/mL，肉眼可见粉红色即弃。
• TG 5 mmol/L 浊度 350 NTU，OD 450 飘高 0.008，高速离心 10 000 ×g 10 min 可去。
• 血清生物素 > 30 ng/mL（常见于美发护肤补剂）抢占 SA，信号被“中和”，稀释 1∶4 后回测，回收率 92 %。

7. 反应条件：25 ℃ 慢温 vs 37 ℃ 快温

• 37 ℃ 30 min 信号高 18 %，背景也高 0.015，CV 从 5 % 升到 8 %。
• 25 ℃ 60 min，板间温差 ≤1 ℃，背景稳在 0.04，适合多中心比对。
• 振荡 400 rpm 可让低值区 OD 再抬 0.02，灵敏度逼近 0.5 mIU/mL，但高值易 hook，需把上限从 1000 降到 800 mIU/mL。

8. 一步法 vs 两步法：速度换特异

• 一步法 45 min 出结果，FSH 交叉 0.3 %，适合急诊。
• 两步法先捕获 60 min→洗→检测 60 min，FSH 交叉降到 0.05 %，科研或 IVF 精确采样优选。
• 同一抗体对，两步法信号强度提高 28 %，代价是总时长翻倍。

9. 结果换算：从 OD 到 mIU/mL 的四参数方程

用 4PL 拟合，引入不对称因子 g，解决低值 0–15 mIU/mL 区段 S 形下压。

公式：

y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)^g) + D

A=OD 0，D=OD 最大，B=斜率，C=EC50，g 0.95–1.05。

R2 ≥ 0.998，残差 < 2 %，才能通过 LIMS 自动审核。