1. 样本前处理：溶血=信号塌方

VEGF 与血小板共储存，采血时针头 <21 G 或抽吸过猛，血小板在针尖破裂，胞内 VEGF 瞬间溢出，浓度可虚高 3–8 倍。

动作清单：

• 19 G 蝶形针，第一管弃掉 0.5 mL。
• 室温 30 min 内离心，1900 ×g 10 min，上层血浆再 10 000 ×g 4 ℃ 10 min 去血小板。
• 溶血指标：OD 414 nm ≥ 0.2 的样本直接淘汰，避免血红蛋白过氧化物酶假阳。

2. 标准曲线：一次做两条，省得返工

VEGF165 标准品溶于 0.5 % BSA-PBS，4 ℃ 存放 48 h 后降解 12 %。

实操：

• 一条曲线当天用，一条分装 ?80 ℃ 冻一次，下次复融 15 min 内上板，两次曲线 R2 差 ≤ 0.01 说明冻融耐受。
• 浓度梯度选 0、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 pg/mL，低区 15.6 pg/mL 能把肉眼下清基础值拉出 0.08 OD，避免“零孔塌陷”。

3. 孵育节奏：25 ℃ 慢温 vs 37 ℃ 快温

说明书给 37 ℃ 1 h，实验室开门窗空调波动 ±2 ℃，边缘孔 CV 直接飙到 18 %。

改法：

• 25 ℃ 恒温箱 2 h，金属浴盖板压顶，蒸发率 < 2 %，整板 CV 压到 6 % 以内。
• 二抗孵育时把板底贴铝箔，避光同时导热均匀，背景 OD 降 0.03–0.04。

4. 洗板：自动与手工的 0.05 mL 死角

自动洗板机喷嘴校准偏差 0.1 mm，会在孔底留下 50 μL 残液，TMB 背景发蓝。

校准：

• 每季度用 0.1 % 酚红溶液空洗，收集残液测 OD 550，残量 ≤ 2 μL/孔才算合格。
• 手工洗板用 8 道排枪，每次 350 μL 1×PBST，正反面各浸泡 30 s，拍干时在滤纸上垂直叩击 3 次，无水印即为合格。

5. 信号读取：动力学法把 3 min 变 10 min

单点读数常落在 TMB 反应爬坡中段，轻微时差就能让 100 pg/mL 样本跳档。

改动力学：

• 加入 TMB 后 37 ℃ 计时，酶标仪 650 nm 动力学读数 10 min，取线性区斜率换算，可把批内 CV 从 9 % 降到 4 %。
• 提前终止法：斜率法与硫酸终止法同时跑，相关系数 0.98 以上再切到斜率 routine，避免硫酸飞溅的废液污染。

6. 异常值追凶：钩状效应藏在 8000 pg/mL

高剂量 hook 在 VEGF 试剂盒里出现概率 0.5 %，样本浓度 > 8000 pg/mL 时，夹心复合物被过剩抗原撑开，OD 反而掉到 500 pg/mL 水平。

识别：

• 每块板随机挑 2 个高值样本做 1∶10 稀释，回算值偏差 > 20 % 即送钩状复检。
• 稀释液必须含 5 % 正常大鼠血清，补充缺失基质，避免稀释后信号假性偏低。

7. 数据输出：把 Excel 模板写成 ELISA 方言

内置公式：

• =IF((Ave_OD-Blank)/(Max_OD-Blank)<0.05,"<15.6 pg/mL",LOGEST(...))
• 自动标黄 R2<0.98 的曲线，标红回收率 80–120 % 以外的样本，审核人一眼定位问题孔。
• 原始 OD、环境温度、试剂批号、操作者缩写四列锁定，审计追踪直接打印，省得 FDA 483 表找上门。