01 抗原形态：LAP 包裹下的 TGF-β1 无法被抗体捕获

TGF-β1 以非共价键被 LAP 包成潜伏复合体，分子量 110 kDa，抗体表位被遮蔽。

酸解离是第一步：

• 1 M HCl 把 pH 调到 2.5，10 min 让 LAP 构象改变，TGF-β1 释放
• 1 M NaOH 回中和至 pH 7.4，抗体识别位点 82–94 aa 完全暴露

不解离直接上机，信号只有游离 TGF-β1 的 8 %，数据被人为压低一个数量级

02 抗体对定位：识别成熟链 82–94 aa 与 110–123 aa 的夹击策略

捕获抗体 clone 1D11 结合成熟链 82–94 aa

检测抗体 clone 9018 结合 110–123 aa

两段序列在 LAP 包裹时空间距离 3 nm，无法同时结合；酸解离后距离 1.2 nm，形成 1:1 三明治

与 latent TGF-β1 交叉 < 0.5 %，与 TGF-β2、β3 同源性 < 5 %，实测交叉 0.05 %

03 信号放大：HRP 底物选择决定线性平台

TMB 显色 0–12 min 斜率 0.0022 OD·pg?1·mL，12 min 后进入平台

实验室把显色时间锁在 10 min，终止后 OD 450 0.8 对应 400 pg/mL，仍在直线段

平台段提前会压缩高值区间，导致 2 000 pg/mL 样本需二次稀释，浪费 2 h

04 背景控制：血清 Latent LAP 酶降解物干扰 0.008 OD

酸解离后 LAP 被蛋白酶切成片段，分子量 25 kDa，与板底塑料非特异结合，背景升高 0.008 OD

在稀释液里加 0.5 % PEG-6000，占位羟基，背景降到 0.003 OD，信噪比由 3 提到 5

05 酸解离终点：pH 2.3–2.7 是平台，低于 2.0 TGF-β1 聚合

pH 2.0 以下 TGF-β1 单体通过疏水面相互聚合，中和后活性损失 30 %

用精密 pH 计校准，HCl 加样误差 ±5 μL，把 pH 控制在 2.5 ± 0.1，回收率 98 %–102 %

每批酸解前用 pH 标准液 4.01 与 7.00 两点校准，防止电极漂移

06 中和缓冲液：Tris 与 PBS 的差异在电导率

Tris-HCl 电导率 1.2 mS/cm，PBS 高达 15 mS/cm，高电导抑制 HRP 酶活 5 %

选用 1 M Tris-Base 回中和，终体积电导率 2 mS/cm，信号不降

Tris 缓冲液现配现用，24 h 后 pH 升 0.2，信号掉 3 %，瓶子写时间戳，超期扔掉

07 读数漂移：终止后 30 min 内 OD 降 0.01

硫酸终止产物在 450 nm 摩尔消光系数随时间下降，30 min 内 OD 掉 0.01

设定终止后 5 min 内读数，误差 < 1 %

板子多时用 384 孔读数仪 90 s 扫完，整批漂移 0.002，可忽略

08 能量换算：四参数拟合 A、D 值与酶标仪光强挂钩

同一台酶标仪光源 800 h 后光强衰减 10 %，D 值由 2.8 降到 2.5，EC50 虚高 5 %

用 250 pg/mL QC 样本生成校正因子 CF = 理论 OD / 实测 OD，所有浓度乘以 CF

CF 每月更新，写入 Excel 模板，拖入原始数据 3 秒完成，板间差从 12 % 拉回 4 %