1. 抗原形态决定信号：血清里 50% 是二聚体，剩余为单体

IFN-γ 活性形式为同源二聚体，单体 16.8 kDa，二聚体通过反平行 β-折叠稳定。捕获抗体若仅识别单体线性表位（如 20-35 aa），二聚体立体位阻导致结合率下降 45%。选识别 95-133 aa 构象表位的抗体对，单体与二聚体 KD 差异 <2 倍，实测血清样本才不会漏检。

2. 夹心模式：鼠 mAb 捕获 + 兔 pAb 检测，避免同型干扰

鼠源单抗 AN-18 对二聚体亲合力 5×10?11 M，生物素化兔多抗检测灵敏度比鼠-鼠配对高 2.3 倍。鼠-鼠配对出现同型空间位阻，高浓度样本出现钩状假阴性，平台 OD 从 3.2 掉到 2.0。说明书标注“mouse capture-rabbit detection”才适合炎症模型 30–2000 pg/mL 的宽范围。

3. 酶标放大：聚 HRP 比传统 HRP 信号高 5 倍，体积大需震荡

链霉亲和素-聚 HRP（~400 HRP/聚合物）能把平台 OD 推到 3.8，LLOQ 从 15 pg/mL 降到 4 pg/mL。聚 HRP 流体力学半径 15 nm，200 μL 体系里浓度高于 0.25 μg/mL 会产生浊度，读数前 5 s 600 rpm 震荡，CV 由 9% 降到 4%。

4. 显色动力学：TMB 8 min 终止最佳，延长 15 min 高值掉信号

IFN-γ 浓度 >500 pg/mL 时 HRP 把 TMB 过度氧化成无色二聚体，8 min 平台 OD 3.5，延长到 15 min 降到 2.9。固定 8 min 终止，用 1 M 硫酸 50 μL，450 nm 读数，高端 CV 压到 5%，低端 4 pg/mL 点 CV 8%。

5. 标准品聚合：复溶后 2 h 内使用，二聚体比例从 92% 降到 75%

冻干标准品含 2% 海藻糖+0.5% 甘露醇，复溶后 4 °C 放置 4 h，二聚体解离成单体，表位暴露度改变，曲线斜率下降 10%。复溶立即分装 50 μL/管，液氮速冻，-80 °C 保存，第二次冻融后二聚体比例维持 90%，斜率变化 <3%。

6. 样本处理：EDTA 血浆抗凝最好，血清凝血过程血小板脱颗粒

血小板含 IFN-γ，凝血过程脱颗粒使血清比 EDTA 血浆高 20–50 pg/mL。研究免疫基线必须统一用 EDTA 血浆，采血后 30 min 内离心，1 000 g 10 min，二次离心 12 000 g 5 min 去血小板，室温放置 >2 h，浓度每 h 下降 5%。

7. 基质效应：溶血血红蛋白 >3 g/L 时 OD 升高 0.05，相当于 6 pg/mL 假阳性

血红蛋白含过氧化物酶活性，催化 TMB 显色。溶血样本用 0.5% 曲拉通 X-100 1:2 稀释，56 °C 加热 8 min 灭活内源酶，冷却后再上板，背景 OD 从 0.08 降到 0.02，IFN-γ 回收率保持 95%。加热时间 >12 min 蛋白聚合，信号下降 15%。

8. 读板策略：450 nm 单波长足够，双波长差减只对高脂有效

IFN-γ 检测背景低，空白 OD 通常 0.02–0.03。高脂血清空白 OD 升到 0.07，用 620 nm 参比差减后回到 0.02，信噪比提升 3 倍。正常血脂样本双波长与单波长结果差异 <2%，不必默认双波长，减少计算步骤。