1. 功能灵敏度 7 pg/mL 才是分界线

官方标 LOD 2 pg/mL 用缓冲液空白+3SD 算出，血清基质里 20% CV 对应 7 pg/mL。健康小鼠血清 GM-CSF 中位 12 pg/mL，炎症模型峰值 800 pg/mL，7 pg/mL 足够区分基线与炎症。脑脊液低丰度样本选 2 pg/mL 档，普通血清实验买 7 pg/mL 档，成本降 30%。

2. 动态范围 7–1000 pg/mL 够用，细胞上清需 1:5 稀释

无血清培养 24 h 后 GM-CSF 累积 2–5 ng/mL，超出上限 5 倍。用无血清培养基 1:5 稀释，回收率 96%，背景降到 200 pg/mL。含 10% FBS 培养基本底 80 pg/mL，换液 4 h 再收集，可把背景压到 15 pg/mL。

3. 校准品溯源：NIBSC 88/646 是唯一冻干标准

88/646 定值 1000 IU/支，约 10 ng 重组 GM-CSF。厂家内部主校准品用 88/646 平行标定，偏差须 <±5%。COA 附“次级-主校准品斜率比”原始记录，缺这一项，换批号后 500 pg/mL 质控偏差可达 60 pg/mL，统计显著性直接消失。

4. 抗体对识别位点：epitope 127-141 aa 避开糖基化

小鼠 GM-CSF 在 127-141 aa 区域无糖基化，捕获抗体 4D4 识别该线性表位，糖基化差异造成的批间 CV <3%。若选 90-110 aa 区域，CHO 表达产物糖链屏蔽，实测 Sp2/0 上清偏低 18%，用大肠杆菌表达校准品无法覆盖，结果虚低。

5. 板内 CV<4% 靠 22 °C 恒温振荡

GM-CSF 分子 14 kDa，扩散慢，22 °C ±0.5 400 rpm 振荡，结合效率最高。室温冬夏差 8 °C，板间 CV 由 4% 升到 8%。恒温振荡器投资 6 k，能把高端平台 OD 从 2.8 提到 3.1，曲线斜率更陡，低端 7 pg/mL 点 CV 压到 8%。

6. 样本稳定性：EDTA 血浆 25 °C 4 h 下降 10%，-80 °C 分装 50 μL 用完即扔

GM-CSF 无血清保护 25 °C 易降解，EDTA 血浆 4 h 损失 10%，血清因含蛋白酶抑制剂损失 5%。采血后 30 min 内离心，分装 50 μL/管，-80 °C 一次用完，冻融 3 次损失 <3%，曲线斜率不变。

7. 读板波长：450 nm 单波长足够，背景 >0.08 先查洗板机

空白 OD 0.02–0.03 正常，>0.08 多为洗板机管道长菌。拆洗头 1% 次氯酸钠浸泡 10 min，纯水反冲，背景回到 0.025，比换抗体便宜。

8. 单位报告：pg/mL 直接写，换算 fmol 放大误差

GM-CSF 14 kDa，1 pg/mL ≈ 0.07 fM，ELISA 测免疫活性，不是质量。直接写 pg/mL of bioactive GM-CSF，审稿人不再要求摩尔换算。