1. 样本收集：麻醉方式影响血清 CCL2 基线

异氟烷麻醉刺激小鼠交感神经，血清 CCL2 从 60 pg/mL 升到 180 pg/mL；二氧化碳窒息 30 s 内采血，数值回落到 80 pg/mL。研究炎症基线必须统一用 CO? 窒息后心脏采血，避免麻醉药自身诱导。

2. 抗凝选择：EDTA 优于肝素，柠檬酸盐会酸化

肝素锂与 CCL2 碱性区结合，回收率 82%；EDTA 2K 回收率 96%。0.109 M 柠檬酸盐抗凝 pH 6.8，CCL2 28 °C 放置 2 h 降解 15%，EDTA 血浆 4 h 内浓度不变。做药动学必须选 EDTA，且 1 000 g 离心 10 min 后 30 min 内上板。

3. 稀释方案：1% BSA-PBS 里加 0.05% Tween-20，吸附损失降到 1%

CCL2 小分子 13 kDa，易贴管壁。纯 PBS 稀释 1:5 损失 25%；加 1% BSA + 0.05% Tween-20，回收率 99%。脑脊液样本量极少，用 0.5 mL LoBind 管，50 μL 起测，避免低丰度被管壁吃光。

4. 酸化激活：CCL2 不需要，但基质金属蛋白酶会剪切

MMP-12 在 pH 6.0 剪切 JE 片段 4-aa，活性形式失活。样本若 pH <7.0，37 °C 2 h 损失 30%。保持中性 pH，EDTA 抑制 MMP，4 °C 存放 <4 h，可完整保留免疫活性。

5. 显色时间：TMB 7 min 终止，延长 15 min 低值反而掉 OD

CCL2 浓度 <30 pg/mL 时 HRP 底物过度氧化生成无色副产物，7 min 平台 OD 0.25，延长到 15 min 降到 0.18。固定 7 min 终止，用 2 M 硫酸 50 μL，450 nm 读数，CV 压到 5%。

6. 背景控制：空白 OD >0.08 先查洗板机残液

空白 OD 0.02–0.03 正常，>0.08 多为洗板机管道长菌。拆洗头 1% 次氯酸钠浸泡 10 min，纯水反冲，背景回到 0.025，比换抗体便宜。

7. 稀释线性：1:2–1:16 范围内 R2>0.99，1:32 掉 12%

高值样本 1 000 pg/mL 1:32 稀释，回收率 88%，原因是稀释液蛋白总量不足，CCL2 贴壁。把 BSA 提到 2%，回收率回到 96%，高端无需二次稀释。

8. 数据报告：单位用 pg/mL，别换算成 fmol

CCL2 13 kDa，1 pg/mL ≈ 0.08 fM，ELISA 测的是免疫活性，不是质量。直接写 pg/mL of immunoreactive CCL2，审稿人不再要求摩尔换算。