1. 先锁定检测对象：VEGF-A 并不只有一条肽链

人 VEGF-A 经选择性剪接产生 VEGF???、VEGF???、VEGF???、VEGF???、VEGF??? 等亚型，血清里 80% 是 VEGF???，肿瘤积液里 VEGF??? 比例升高。抗体若识别 121-165 共同区，结果能反映总量；若只抓 165 C 端 25 aa，VEGF??? 阳性样本会被低估 60%。研究肿瘤血管新生选“总 VEGF-A”试剂盒，研究心肌缺血再灌注选“VEGF??? 特异”试剂盒，COA 里必须写明识别位点。

2. 灵敏度不是越低越好，功能灵敏度 9 pg/mL 覆盖 95% 健康人

健康人血浆 VEGF 中位 18 pg/mL，慢性肾病可到 900 pg/mL。厂家标 LOD 3 pg/mL 用缓冲液空白+3SD 算出，血清基质功能灵敏度 20% CV 对应 9 pg/mL。低于 9 pg/mL 的数据 CV 25%，写文章分不了组。把 LLOQ 设在 9 pg/mL，比追求 3 pg/mL 更实用，省掉重复孔。

3. 样本类型写进合同：血清、EDTA 血浆、柠檬酸盐血浆数值差 12%

血小板含大量 VEGF，凝血过程脱颗粒使血清比 EDTA 血浆高 12–30%。研究血管新生必须统一用 EDTA 血浆，采血后 30 min 内离心，1 000 g 15 min，二次离心 10 000 g 10 min 去血小板，否则基线虚高。肿瘤积液细胞成分多，先 0.22 μm 过滤再测，避免细胞分泌造成读数漂移。

4. 校准品溯源：WHO NIBSC 02/150 是 VEGF??? 唯一国际品

试剂盒若用内部重组校准，需用 NIBSC 02/150 做并行标定，偏差 <±8%。COA 附“主校准品批号-次级校准品斜率比”原始记录，缺这一项，不同批次间 60 pg/mL 质控品能差出 10 pg/mL，统计 p 值直接消失。要求厂家每批随货 20 μL 高值校准品，实验室自己回测斜率，落在 0.9–1.1 才签收。

5. 抗体对决定回收率：鼠-兔配对比鼠-鼠高 8%

VEGF 表位含二硫键，鼠源单抗 3.5F8 识别 107-122 aa，兔多抗检测亲和力 2×10?11 M，血清回收率 96%。鼠-鼠配对出现空间位阻，回收率 88%，高值样本出现“钩状”假阴性。说明书标注“mouse capture-rabbit detection”才放心，若写“matched mouse antibodies”要问清是否不同亚型。

6. 动态范围 15–2000 pg/mL 够用，但细胞上清需 1:10 稀释

细胞上清经无血清培养 24 h，VEGF 累积 5–30 ng/mL，超出上限 10 倍。用无血清培养基把样本 1:10 稀释，回收率 93%，背景降到 2 ng/mL。含 10% FBS 培养基本底 0.8 ng/mL，需换液 6 h 再收集，避免牛 VEGF 干扰。试剂盒若无法承受 1:10 稀释，高端线性掉 20%，选能支持 1:50 稀释的型号。

7. 板条可拆 vs 整板：96T 拆 3 次用完，校准品冻融 6 次损失 7%

VEGF 校准品不含甘油，-20 °C 结冰，冻融 6 次浓度从 1000 pg/mL 降到 930 pg/mL，低端 15 pg/mL 点 CV 由 5% 升到 11%。选独立铝箔袋 8T×12 条，拆封后 4 °C 放 4 周信号无衰减。整板包装拆封后 4 周校准品 OD 下降 0.05，相当于 6 pg/mL 漂移，做大队列必须一次用完。

8. 售后：数据异常 24 h 内给实验复核方案

VEGF ELISA 常见异常：空白 OD>0.1、稀释线性失败、回收率 <85%。优质供应商附“异常数据回传模板”，48 h 内给出替换抗体或补偿试剂。合同里写清：若复核确认试剂缺陷，厂家承担样本重测费用，按每样本 100 元计算。没有这条，出问题只能自己承担。