1. 抗原形态决定读数：血清里 90% 是三聚体，单体只占 3%

TNF-α 在溶液里以三聚体稳定存在，单体半衰期 <30 s。捕获抗体若识别单体线性表位（如 59-80 aa），三聚体立体屏蔽导致结合率下降 40%。选抗体对时要求识别构象表位，定位在 87-108 aa 的 β-折叠区，三聚体与单体 KD 差异 <2 倍，实测血清样本才不会漏检。

2. 夹心模式：捕获选鼠 mAb，检测选兔 pAb，避免竞争

鼠源单抗 2C8 对三聚体亲合力 3×10?1? M，生物素化兔多抗检测灵敏度比鼠-鼠配对高 1.8 倍。鼠-鼠配对出现同型空间位阻，高浓度样本反而信号下降，出现“钩状”假阴性。说明书里标注“suggested antibody pair”含 2C8 + rabbit pAb，才适合炎症风暴血清 0.5–10 ng/mL 的宽范围。

3. 酶标放大：链霉亲和素-聚 HRP 比传统 HRP 高 6 倍信号

传统 1:1 HRP 标记最大 OD 1.2，聚 HRP（~400 HRP/聚合物）能把平台 OD 推到 3.5，LLOQ 从 15 pg/mL 降到 4 pg/mL。聚 HRP 体积大，200 μL 体系里浓度高于 0.2 μg/mL 会产生浊度，读数前 5 s 震荡不可省，否则 CV 从 3% 升到 9%。

4. 显色动力学：TMB 7 min 终止最佳，延到 15 min 低值反而掉信号

TNF-α 浓度 <30 pg/mL 时，延长显色时间信号继续爬升，>30 pg/mL 后 7 min 达到平台。原因在于高浓度 HRP 把 TMB 氧化成双产物，其中一种无色。实验室把终止时间固定在 7 min，用 8 点校准曲线回算，低端 4 pg/mL 点 CV 才能压到 8% 以内。

5. 标准品聚合：冻干品复溶后 2 h 内使用，三聚体比例从 95% 降到 80%

冻干标准品含 2% 海藻糖+0.5% 甘露醇，复溶后 4 °C 放置 4 h，三聚体解离成单体+二聚体，表位暴露度改变，曲线斜率下降 12%。复溶立即分装 50 μL/管，液氮速冻，-80 °C 保存，第二次冻融后三聚体比例维持 93%，斜率变化 <3%。

6. 样本处理：EDTA 血浆抗凝最好，肝素锂会产生 15% 负偏差

肝素与 TNF-α 碱性区结合，遮蔽 87-108 aa 表位，回收率 85%。EDTA 抑制金属蛋白酶，减少 5% 降解，同时不干扰抗体。血清样本凝血过程血小板脱颗粒，额外释放 TNF-α 0.2–0.4 ng/mL，测炎症基线时必须用 EDTA 血浆。采血后 2 h 内 1 000 g 离心 15 min，室温放置 >4 h，浓度每 h 下降 6%。

7. 基质效应：溶血血红蛋白 >5 g/L 时 OD 升高 0.06，相当于 8 pg/mL 假阳性

血红蛋白含过氧化物酶活性，催化 TMB 显色。溶血样本用 1% 曲拉通 X-100 1:2 稀释，56 °C 加热 10 min 灭活内源酶，冷却后再上板，背景 OD 从 0.09 降到 0.02，TNF-α 回收率保持 95%。加热时间 >15 min 蛋白聚合，信号反而下降 20%。

8. 读板策略：450 nm 单波长足够，双波长差减只对高脂有效

TNF-α 检测背景低，空白 OD 通常 0.02–0.03。高脂血清空白 OD 升到 0.08，用 620 nm 参比差减后回到 0.025，信噪比提升 3 倍。正常血脂样本双波长与单波长结果差异 <1%，不必默认双波长，减少计算步骤。