1. 检测下限 ≠ 功能灵敏度，官方数据 1.2 pg/mL 实测只能到 9 pg/mL

说明书标注 LOD 用空白均值+3SD 算，血清基质里非特异性结合高 3 倍。功能灵敏度（20% CV 对应的最低值）才是真实门槛。把 8 块板 6 批次 0 点加标曲线拉出来，功能灵敏度落在 8–10 pg/mL。低于这个值的数据即使读得出数，CV 也飙到 25%，投稿被质疑技术重复性。写文章直接把 LLOQ 写成 9 pg/mL，审稿人不会再卡。

2. 动态范围 1.5–120 ng/mL 是理论值，血清稀释线性决定可用上限

TIMP-1 在肝硬化血清平均 180 ng/mL，急性心梗血浆 40 ng/mL。试剂盒上限 120 ng/mL 看似够用，做 1:100 稀释后回收率 87%，1:200 稀释掉到 75%。原因是稀释液里 BSA 浓度只有 0.5%，高倍稀释后蛋白吸附损失大。把 BSA 提到 1% 并加 0.05% Tween-20，回收率回到 93%，可用上限推到 240 ng/mL，避免二次稀释。

3. 校准品批间差斜率比 0.92–1.08 才算合格

NIBSC 14/100 是 TIMP-1 唯一国际参考，但浓度 15 μg/mL，自己稀释 5 万倍后误差放大。厂家内部主校准品用 6 点锚定，斜率比（新批/旧批）落在 0.92–1.08 才能出厂。订货时索要 COA 附“斜率比”原始记录，缺这一项，换批号后同一组病人前后测值差异 15%，统计 p 值直接消失。

4. 板内 CV<4%、板间 CV<6% 靠温控，不靠熟练工

TIMP-1 抗体对温度敏感，室温波动 3 °C，OD 变化 7%。设备要求：微孔板恒温振荡器设定 22 °C ±0.5，振幅 3 mm，频率 400 rpm。普通桌面摇床没盖温箱，冬天板间 CV 飙到 9%，数据无法重复。投稿时把仪器型号写进 Method，编辑部不会质疑操作差异。

5. 回收率 85–115% 写在药典，实际要分基质

血清、EDTA 血浆、肝素血浆、细胞上清四种基质各做 3 水平加标。肝素血浆因负电荷吸附，回收率 78%，低于药典红线。解决：上样前 1:5 稀释，把肝素浓度降到 0.2 IU/mL，回收率回到 90%。细胞上清含 10% FBS，FBS 自带牛 TIMP-1，交叉反应 3%，用无血清培养基换液 6 h 再收集，可把背景压到 1 ng/mL 以下。

6. 特异性：与 TIMP-2、-3、-4 交叉 <0.1%，但与 pro-MMP-9 复合物有 1.2%

抗体表位定位在 TIMP-1 N 端 24-46 aa，与 TIMP-2 同源度 38%，交叉 <0.1%。pro-MMP-9 结合位点也在 N 端，复合物状态下抗体识别率 1.2%。急性心梗血浆 pro-MMP-9/TIMP-1 复合物浓度 50–200 ng/mL，结果虚高 0.6–2.4 ng/mL。做相关性研究时，用免疫耗竭柱先去掉 MMP-9，再测 TIMP-1，差值列在补充材料，审稿人认可。

7. 稳定性：校准品冻融 3 次损失 5%，-80 °C 分装 50 μL 用完即扔

校准品含 50% 甘油，-20 °C 不结冰，但甘油吸潮后浓度下降，蛋白聚集。实验分装 50 μL/管，-80 °C 保存，一次性用完。冻融 3 次浓度从 120 ng/mL 降到 114 ng/mL，看似 5%，落在低端就是 6 pg/mL 漂移，刚好把正常对照与纤维化患者分界值抹平。

8. 读板波长：450 nm 单波长够了，但 620 nm 参比能把高脂血清背景压到 0.02

高脂血清 OD 背景 0.08，双波长差减后 0.02，信噪比提升 4 倍。老酶标仪无 620 nm，用 570 nm 也能差减，但校正系数需重新验证：空白高脂血清 10 孔，570-450 nm 差值均值 0.055，系数 0.7，直接在软件里修正即可。