1. 目标分子真面目：p19+p40 异源二聚体

IL-23 由 IL-12p40 与 IL-23p19 通过二硫键铰链而成，分子量 54 kDa。试剂盒若写“测 IL-23p19”，只抓 p19 单链；写“测 IL-23 heterodimer”，必须同时识别 p19 与 p40 的交界表位。选购前先对需求：研究 Th17 机制选异源二聚体，探 p19 表达量选单链，混着买会得出两套不重叠数据。

2. 捕获抗体定位：p19 氨基端 AA 20–35 是最优靶区

p19 与 IL-12p40 共享 p40 亚基，捕获抗体若落在 p40 面，会同时拉来 IL-12。正规试剂盒把表位锁定在 p19 N 端 AA 20–35，远离 p40 接触面，交叉 < 0.05 %。索要抗体表位图，缺图就默认能抓 IL-12，结果把 300 pg/ml 的 IL-12 当成 IL-23 报上去。

3. 检测抗体策略：生物素-链霉亲和素放大 4 倍信号

检测抗体识别 p40 C 端，但只认“已与 p19 结合”的构象，形成夹心后标记生物素。链霉亲和素-HRP 四价结合，使单个复合物带 4 分子 HRP，LOD 从 15 pg/ml 压到 5 pg/ml。说明书未提生物素化，多半用直标 HRP，信号弱一倍，高端 OD 难上 2.0。

4. 标准品构象：单链 p19 还是完整异源二聚体

冻干标准品若只含 p19，无法模拟真实血清里的二聚体构象，回收率掉 25 %。靠谱盒用 CHO 共表达 p19+p40，再经亲和层析纯化出完整 IL-23，浓度用 NIBSC 16/176 校准，1 IU = 18 pg。COA 上无 16/176 对标，浓度绝对值无人背书。

5. 显色反应：TMB 底物高离子强度防止复合物解离

IL-23 二聚体在低盐环境易解离成 p19+p40。TMB 缓冲液里加 0.15 M NaCl，维持离子强度，复合物保持完整，标曲高端 OD 不降。说明书若写“TMB 低盐配方”，高端信号普遍下滑 12 %，需额外延长显色时间补信号。

6. 样本处理：EDTA 血浆需补 2 mM Mg2?

EDTA 螯合 Mg2?，IL-23 构象松动，回收率掉到 70 %。稀释液里补 2 mM MgCl?，可把回收率拉回 95 %。厂家未注明 Mg2? 补偿，自己加 1 μl 1 M MgCl? 到每 500 μl 稀释液，成本 0.02 元，比换试剂盒划算。

7. 背景控制：链霉亲和素预封闭 30 min

血清里内源生物素 compete 生物素化抗体，背景飙高。提前用 5 μg/ml 链霉亲和素 37 °C 封闭板条 30 min，再跑样本，空白 OD 从 0.08 降到 0.03，省一批空白孔。

8. 读数窗口：终止后 3 min 内完成

终止液硫酸使 IL-23 复合物电荷改变，OD 450 nm 随时间下降 2 %/min。设定闹钟，终止完 3 min 内读数，漂移 < 1 %。超过 10 min 的板子直接作废，别让审计官抓到时间差。

9. 数据拟合：四参数 logistic 固定斜率因子

IL-23 标曲高端 1000 pg/ml 常出现“肩峰”，软件强拉 R2 0.999 但低值被高估。把四参数 logistic 的斜率因子固定为 0.85，低端 15–60 pg/ml 回算偏差从 18 % 缩到 5 %，发文章不用额外文字解释。

10. 结果单位：pg/ml 与 IU/ml 双报告

NIBSC 16/176 赋予国际单位，审稿人常要求双单位。模板里加一列“IU/ml”，公式 =pg/ml÷18，一次性给出，省去返工。