1. 抗原表位定位：成熟 IL-6 段 29–212 外的前体肽才是干扰源

• 前体 1–28 信号肽在分泌后 5 min 内被剪切，但细胞裂解液里完整前体占比仍达 12 %
• 捕获抗体 clone 6H7 识别 44–58 环，检测抗体 clone 8D7 落在 172–185，两段均不在前体区，保证血清与细胞上清数据可比

2. 抗体对亲和力：Kd ≤ 45 pM 才能把功能灵敏度压到 0.5 pg/mL

• 亲和力用 Bio-Layer Interferometry 实测，6H7 结合速率 ka 4.8 × 10? M?1s?1，解离速率 kd 2.1 × 10?? s?1，Kd 43 pM
• 亲和力 < 100 pM 时，2 pg/mL 点 CV 从 12 % 降到 6 %，注册检无需额外重复实验

3. 标准品糖型：HEK293 表达与血清糖型相似度 0.96

• E. coli 表达缺失 2 位 N-糖基化，与血清天然 IL-6 结合效率差 22 %
• 糖型用 HPLC 电荷分布测定，HEK293 标准品与 NIBSC 89/548 相似度 0.96，回收率曲线斜率 0.99–1.01，可直接用于定量血清

4. 链霉亲和素-HRP 摩尔比 1:1，信号噪声双控

• 摩尔比 1:2 信号高 10 %，非特异吸附同步升高 35 %
• 1:1 摩尔比 Rz 值 ≥ 3.0，15 min 显色窗口内 OD 450 0.04–3.0 线性，背景 OD 稳定在 0.03 以下

5. 底物动力学：25 °C 下 TMB 12 min 平台，37 °C 缩短至 6 min

• 平台后斜率 < 0.001 OD/min，温度每升高 1 °C 平台提前 15 s
• 恒温金属浴 25 °C，读数窗 12 min，四参数拟合 A 值批间差异从 6 % 降到 1.2 %

6. 酸解除复合：0.15 M 甘氨酸-HCl pH 2.7 释放 IL-6/sIL-6R 复合物

• 血清中 25 % IL-6 与 sIL-6R 结合，检测值偏低 35 %
• 0.15 M 甘氨酸-HCl pH 2.7 处理 10 min，Tris 中和后回收率 96–104 %，每批加复合物 QC，偏差 > 10 % 当日数据作废

7. 钩状效应验证：100 ng/mL 高剂量不回降

• 脓毒血症峰值可达 50 ng/mL，普通 Kit 只验证 10 ng/mL
• 参数表写明“Hook 验证至 100 ng/mL，回收 > 90 %”，高剂量样本无需二次稀释，节省 2 周验证时间

8. 背景校正：650 nm 二次读数，扣血红素干扰

• 溶血样本 650 nm 吸光度 0.08，单波长读数虚高 0.016
• 双波长 450–650 nm 校正，背景 OD 直接扣到 0.01 以下，定量下限保持 0.5 pg/mL，不受 5 g/L Hb 影响

9. 数据拟合：四参数 1/Y2 加权，低浓度残差 < 5 %

• 曲线跨度 0.5–2000 pg/mL，不加权重低浓度残差 18 %
• 1/Y2 加权后 2 pg/mL 点残差 4 %，注册检功能灵敏度直接通过，无需额外缩小线性区间

10. 读数链路：二维码绑定原始 OD、校准曲线、操作员 ID

• 每孔生成唯一二维码，扫码 3 秒调出孵育曲线、洗板机压力、SA-HRP 批次
• 离群值可追溯至单次移液误差，GLP 审计零纸质记录，FDA 现场核查零发补