1. 样本稀释：先 1:2 预实验，再决定一步还是两步

IL-4 血清基线 2–20 pg/mL，CAR-T 回输后峰值 500 pg/mL。

• 先随机抽 3 份高值血清做 1:2、1:5、1:10 稀释，回收率落在 90–110 % 的最小稀释倍数即为正式稀释比。
• 两步稀释用 1 % BSA-PBS 作缓冲，避免单一高倍稀释造成 OD 低于 0.05，仪器重复误差放大。

2. 酸解除复合：0.2 M 甘氨酸-HCl pH 2.5，10 min 搞定

IL-4 与可溶性 IL-4Rα 形成 1:1 复合物，检测值偏低 40 %。

• 加入等体积 0.2 M 甘氨酸-HCl pH 2.5，室温 10 min 解离，再用 1 M Tris 中和至 pH 7.2，回收率回到 95–105 %。
• 每批样本带一个复合物 spiked QC，偏差 > 10 % 当天数据作废。

3. 孵育节奏：25 °C 振荡 100 rpm，链霉亲和素-HRP 提前 15 min 取出

37 °C 快速模式信号高 8 %，背景也高 15 %。

• 25 °C 微孔振荡器 100 rpm，捕获 2 h + 检测 1 h + SA-HRP 30 min，信噪比稳定在 25:1。
• SA-HRP 提前 15 min 取出混匀，避免 4 °C 储存结晶造成浓度虚高，背景 OD 从 0.08 降到 0.03。

4. 洗板压力 0.5 psi，流量 250 μL/s，五轮就足够

压力 1.0 psi 会把抗体剥离 0.6 %/循环，低浓度点 CV 飙到 8 %。

• 设置 0.5 psi，流量 250 μL/s，300 μL/孔×5 次，板内 CV 压回 3 % 以内，省一次洗板机维护成本。

5. 显色窗口：TMB 8 min 内读数，超时用 650 nm 二次校正

TMB 37 °C 8 min 后斜率 < 0.001 OD/min，温度每升高 1 °C 平台提前 20 s。

• 25 °C 下允许 12 min 窗口，终止后 10 min 内读数；超时用 650 nm 背景校正，OD 450–650 差值维持线性，高剂量 Hook 样本不会误判。

6. 标准品分装：冻干 0.5 mL/管，-80 °C 6 个月稳定

预稀释 7 瓶套装开封 24 h 失效，年用 30 块板浪费 40 % 成本。

• 选冻干 1 μg/瓶，自配 0.5 mL 复溶后分装 50 μL/管，-80 °C 存 6 个月，偏差 < 5 %，平均单孔成本降 35 %。

7. 数据追溯：每孔二维码链原始 OD、稀释倍数、操作员 ID

离群值 3 秒调出当日孵育曲线、洗板机压力日志，GLP 稽查零纸质。

• Excel 模板自动标注复合物解离 QC、酸活化 pH、中和后电导，审计官直接扫码签字，无需翻纸质记录。

8. 仪器校准：450 nm 滤光片中心波长偏差 ≤ 2 nm

TMB 450 nm 峰宽 30 nm，滤光片 448 nm 与 452 nm 相比 OD 差 7 %。

• 每季度用 NIST 可追溯 OD 1.0 标准玻片校准，偏差 > 2 nm 立即更换滤光片，不同实验间数据差从 8 % 降到 1 %。

9. 批次桥接：一块板混插 6 点标准，斜率比 0.98–1.02 通过

新旧批次各取 6 点标准混插，四参数斜率 a 比值 0.98–1.02 视为等效。

• 记录斜率比，下次换批直接把样本测值乘以系数，省去 40 份血清桥接实验，节省 5 个工作日。

10. 废液处理：终止液含 2 M H?SO?，中和到 pH 6–8 再排放

TMB 终止液 2 M H?SO?，直接排放下水 pH < 2，违反环保条例。

• 用 5 M NaOH 中和到 pH 6–8，电导 < 20 mS/cm，在线 pH 计确认后排放，GLP 审计不再开整改条。