1. 捕获抗体定位：锁定 Pro-region 的 102–115 环

IL-1α 前体全长 271 aa，分泌后 N 端 1–113 段仍挂在蛋白表面。

• 优质 Human IL-1α ELISA Kit 采用 clone 340F2，识别 102–115 环，远离 IL-1Ra 同源区，交叉 <0.05 %。
• 说明书未给出表位区间，直接索要 epitope mapping 报告，无报告视为无效抗体对。

2. 检测抗体生物素化：定点标记重链 K246

随机生物素化易落入 Fc，链霉亲和素-HRP 靠近后空间位阻升高，背景 OD 飙到 0.12。

• 选择重链 K246 定点标记，标记率 0.98–1.02，信噪比降至 0.03。
• 自己复核时，用 0.5 M NaCl 高盐洗板一次，可再削 20 % 非特异结合。

3. 标准品糖型：HEK293 表达才跟血清平行

大肠杆菌表达缺失 O-糖基化，与天然蛋白结合效率差 18 %。

• 试剂盒标准品若注明“HEK293 表达、糖型图谱与 NIBSC 86/680 相似度 0.96”，稀释线性才可信。
• 做细胞上清时，糖型差异可被稀释掩盖；做血清必须要求 HEK293 来源，否则回收率曲线斜率 0.8–1.2 无法通过。

4. 链霉亲和素-HRP 摩尔比：1:1 最优

摩尔比 1:2 虽信号高 15 %，但非特异吸附同步上升 40 %。

• 参数表写明“SA-HRP 摩尔比 1:1，Rz≥3.0”，保证 15 min 显色窗口内 OD 450 0.05–3.0 线性。

5. 底物动力学：TMB 8 min 进入平台期

37 °C 下 TMB 氧化曲线 8 min 后斜率 <0.001 OD/min，温度每升高 1 °C 平台提前 25 s。

• 把孵育盒放在 25 °C 恒温金属浴，读数时间窗可放宽到 12 min，四参数拟合 A 值差异从 6 % 降到 1.5 %。

6. 酸活化步骤：解离 IL-1α/IL-1R2 复合物

血清中 30 % IL-1α 与诱饵受体 IL-1R2 结合，ELISA 测值偏低 50 %。

• 加入 100 mM 甘氨酸-HCl pH 2.5 处理 10 min，立即用 1 M Tris 中和，回收率回到 95–105 %。
• 酸活化写入 SOP，每批带一个复合物 spiked QC，可监控解离效率。

7. 高剂量 Hook 验证：锁定 50 ng/mL

前体 IL-1α 在败血症血清可达 40 ng/mL，普通 Kit 只验证 10 ng/mL。

• 参数栏直接印刷“Hook 验证至 50 ng/mL，回收 >85 %”，临床高剂量样本无需二次稀释确认。

8. 背景校正：650 nm 二次读数

TMB 产物在 650 nm 有 5 % 残峰，单波长读数高背景样本 OD 450 虚高 0.02。

• 仪器设置 450–650 nm 双波长校正，背景 OD 直接扣到 0.01 以下，定量下限从 3.8 pg/mL 压到 2.1 pg/mL。

9. 洗板压力：0.5 psi 最优

压力 1.0 psi 时，微孔底部薄膜被冲起，抗体剥离率 0.5 %/循环，板内 CV 从 4 % 升到 7 %。

• 把洗板机压力调到 0.5 psi，流量 250 μL/s，300 μL/孔×5 次，CV 直接压回 3 % 以内。

10. 数据拟合：四参数权重 1/Y2

IL-1α 标准曲线跨度 2–2000 pg/mL，低浓度点绝对误差对拟合影响被高浓度淹没。

• 选择 1/Y2 加权，四参数拟合在低浓度区残差 <2 %，定量下限准确度从 ±15 % 提升到 ±8 %，注册检一次通过。