培养箱微环境巡检

温度与 CO? 探头每月校准一次，误差范围 ±0.1 °C 与 ±0.05 %。断电重启后，先空箱运行 2 h；细胞放回前用独立温度计确认 37 °C 平台稳定，避免 SV40T 因温度应激触发 p53 残留活性，导致倍增时间突然延长。

培养基批次锁定

每批 FBS 入库前做 48 h 平行测试：取 P15 细胞，记录倍增时间、细胞直径、上清 IL-8 浓度。三项指标与旧批次差异>10 % 即退货。IL-8 是最敏感的漂移指针，可提前 3 代预警。

支原体季度围剿

每季度第一周执行“双杀”策略：先用 MycoAlert 生化法初筛，再用 PCR 复核。出现阳性即整批丢弃，并对培养箱、移液器、试剂架 75 % 酒精+紫外 30 min 联合消毒。污染记录上传云端，其他课题组实时可见，避免二次波及。

代数红线与备份

P0–P25 为黄金期，P26–P40 为警戒期，P41 强制退役。警戒期内每 3 代核型抽检，发现 8 号三体或端粒长度 <6 kb 立即启用早期备份。备份策略：P5、P15、P25 各冻存 10 支，液氮气相 -150 °C，二维码追溯。

冻存复苏“慢启动”

冻存管 37 °C 水浴 90 s 后，立即转入 15 mL 预热培养基稀释 DMSO。离心 200 g 3 min，重悬后 24 h 内不移动培养瓶。第 1 代不做任何药物处理，防止 SV40T 表达短暂下调导致 P53 反弹。

消化节奏控制

0.05 % Trypsin-EDTA 37 °C 60 s 足以让 90 % 细胞脱落。超时 15 s 即出现膜蛋白 CD90 阳性率下降。终止时加入含血清培养基 1:2 稀释胰酶，轻柔吹打 3 次即可，避免机械损伤触发衰老相关 β-gal 染色升高。

交叉污染防火墙

同一超净台只处理一株细胞。每日结束实验后，用 0.1 % 次氯酸钠擦拭台面，紫外 30 min。每月一次 STR 抽检，任意位点差异>1 个重复序列即启动全库排查。排查期间相关实验暂停，确保数据纯净。

数据化日志

在线表单一键记录：传代日期、代数、活率、试剂批号、操作人。系统自动计算倍增时间，提前 2 代邮件提示进入警戒期。日志与 COA 同步开放，审稿人扫码即可核对实验条件。