细胞身份与命名规则

官方编号：CAF-HPV-Immortal-23P

规则：CAF 指癌相关成纤维，HPV 代表 E6/E7 永生化基因，23P 为 2023 年建系批次。STR 核心位点 D5S818=11,12；D13S317=9,11；D7S820=10,10，与任何公开库无重叠，确认独立株系。

基因插入与拷贝数

• E6/E7 来源：HPV-16 全长 ORF，密码子优化后去除致癌 p53 结合热点，保留 Rb 降解功能
• 载体：慢病毒 pLVX-EF1α 启动子，MOI=2，单拷贝整合于 AAVS1 安全港
• qPCR 拷贝数：E6=1.02±0.05，E7=1.08±0.04，无多拷贝沉默风险

倍增与代数窗口

• PDT：22–26 h（DMEM+10 % FBS，37 °C，5 % CO?）
• 官方窗口：P0–P35 为实验黄金期，P36–P55 为警戒期，P56 起强制退役
• 警戒期内每 5 代提交核型图，非整倍体>3 % 立即淘汰

表面标志物基线值

• CD90-FITC：98.4 %±0.7 %（MFI 4.7×10?）
• CD73-PE：97.9 %±0.8 %（MFI 3.9×10?）
• CD45-APC：<0.3 %
• α-SMA 免疫荧光阳性率：≥92 %，呈典型应力纤维

功能分泌谱（ELISA，48 h）

• IL-6：5.3±0.4 ng/mL
• TGF-β1：680±50 pg/mL
• VEGF-A：2.1±0.2 ng/mL
• CXCL12：1.4±0.1 ng/mL

批次间 CV<8 %，随货附原始曲线

三系分化潜能

• 成骨：21 天茜素红阳性结节 ≥80 %，RUNX2 表达上调 12 倍
• 成脂：14 天油红 O 脂滴染色 ≥70 %，PPARγ 上调 9 倍
• 成软骨：微团培养 21 天甲苯胺蓝异染 ≥75 %，SOX9 上调 8 倍

分化后标志物 qPCR 与原代差异 <1.3 倍，证实多向潜能保留

核型与基因组安全

• 基线核型：46,XY 或 46,XX，30 代内无克隆性异常
• CNV 负荷：<0.02 事件/Mb（0.5× WGS）
• p53 热点测序：无突变，E6 结合域沉默突变已去除

无菌与病毒安全

• 支原体：荧光法+PCR 双阴性，灵敏度 10 CFU/mL
• 病毒筛查：HBV、HCV、HIV、EBV、CMV qPCR 阴性
• 内毒素：<0.1 EU/mL，可直接用于动物移植

运输与储存规格

• 冻存管：1 mL，5×10? cells，90 % FBS+10 % DMSO
• 干冰：≥5 kg，48 h 内送达
• 液氮长期：气相 -150 °C，10 年存活率>85 %

配套培养基组成

• 基础：DMEM 高糖+GlutaMAX
• 添加：10 % FBS（批次验证）、1 % ITS-X、1 % NEAA、55 μM β-巯基乙醇
• 抗生素：Pen-Strep 100 U/mL，常规培养 2 代后撤除