到货检查与开箱动作

收到干式液氮罐后，30 分钟内完成开箱。核对运输温度记录——全程需 ≤ -150 °C。冻存管外壁若出现裂纹或标签模糊，立即拍照并联系供应商。条码扫描入库，记录批次号、到货时间、运输箱编号，避免后期数据溯源时找不到源头。

复苏三步曲：温度、离心、铺板

37 °C 水浴 90 秒，管口保持在液面以上防止污染。转入 15 mL 离心管，预温的 9 mL 完全培养基沿管壁缓慢滴加，800 rpm 离心 3 分钟。弃上清后轻弹管底，用 1 mL 培养基重悬，移入 T25 瓶。关键点：重悬时避免气泡，细胞团一旦形成，贴壁率会从 95 % 掉到 70 % 以下。

首日培养：低血清驯化策略

SV40T 永生化株对血清批号敏感。复苏当天用 5 % FBS 的 DMEM/F12 过渡，次日再升至 10 %。镜下观察可见 4 h 内出现伪足，12 h 完成首次铺展。若 24 h 仍未完全贴壁，检查培养箱 CO? 浓度是否准确，或更换新批次血清。

日常传代：胰酶时长的“秒表法”

0.25 % Trypsin-EDTA 覆盖细胞面后立即计时，33 °C 放置 55 秒。轻拍瓶壁出现“流沙”样脱落即终止，加 2 mL 完全培养基中和。每次传代比例 1:3，第五天达到 80 % 汇合。延迟传代会导致细胞扁平、倍增时间从 28 h 拉长到 40 h。

抗生素梯度：双保险防污染

培养体系加入 100 U/mL Pen-Strep 作为常规预防。若怀疑隐性污染，48 h 内改用 2 μg/mL Plasmocin 处理，随后回到常规浓度。SV40T 株对 Plasmocin 耐受上限 5 μg/mL，超过此值细胞周期阻滞在 G2/M。

冻存回传：高密度+慢速降温

收集对数中期细胞，密度调至 3 × 10^6 cells/mL。冻存液配方：90 % FBS + 10 % DMSO，混匀后 4 °C 静置 10 分钟。使用程序降温盒以 -1 °C/min 降至 -80 °C，次日转入液氮。回传复苏存活率稳定在 92 %，高于普通梯度冻存法 10 个百分点。

功能实验前的同步化处理

实验前 24 h 将血清降至 2 % 同步细胞周期。加入 10 ng/mL EGF 与 5 μg/mL 胰岛素可快速拉回增殖状态，避免 G0 期堆积影响下游 EdU 掺入或细胞毒性读值。同步化后 EdU 阳性率从 35 % 提升至 68 %，实验窗口延长 48 h。

交叉污染排查：每月 STR 快检

每连续培养 5 代，取 1 × 10^5 细胞送 STR 快检，20 个位点与 DSMZ 数据库比对。出现任意位点偏移 > 2 个重复单元即判定污染，整批细胞封存。实验室内部建立“污染档案”，记录污染源与批次号，方便追溯。

常见问题速查表

数据记录模板

每日记录：汇合度、换液时间、传代比例、抗生素批号、实验项目。使用电子表格自动生成倍增时间曲线，R2 < 0.98 提示潜在异常，提前干预。