把一次冻存事故扼杀在摇瓶之前。

日常巡检：显微镜下的 30 秒诊断

相差 10× 视野内出现黑点时，先用 400× 确认运动性。支原体污染在 400× 呈布朗运动，碎片静止。发现运动颗粒立即做 Hoechst 33258 荧光染色，支原体阳性呈现胞外蓝色点状。记录时间点、照片、批次号，24 h 内报告供应商，冻存备份即刻封存。

换液节奏：48 h 全换 vs 24 h 半换

完全培养基含 2 % FBS + EGM-2 单因子包，VEGF 半衰期 6 h。半换液导致 VEGF 浓度波动 60 %，细胞迁移划痕实验重现性下降 30 %。标准做法是 48 h 全量换液，提前 1 h 将培养箱内预温皿数与换液批次对应，避免室温暴露引起 pH 漂移。

消化边界：0.05 % Trypsin-EDTA 2.5 min 红线

0.25 % Trypsin 会剪切整联蛋白 β1，影响后续管腔形成。实验级 0.05 % Trypsin-EDTA 37 ℃ 2.5 min 内 95 % 细胞圆缩，立即加入 2 mL 含血清终止液。超时 30 s，细胞表面 ICAM-1 表达量下降 20 %，白细胞黏附实验数据失真。

冻存密度与梯度降温

冻存液配方：90 % FBS + 10 % DMSO，细胞密度 1 × 10? mL?1。梯度降温盒 -1 ℃ min?1 至 -80 ℃，次日入液氮。密度低于 5 × 10? mL?1，复苏后 48 h 增殖曲线出现滞后相，倍增时间从 28 h 延长至 40 h。记录每盒放置位置，避免液氮罐顶部温度波动区。

液氮罐交叉污染隔离

专罐专架，每盒贴 NFC 芯片，扫码即查入库时间、批次、位置。公用罐需每月检测液氮支原体 qPCR，阳性罐整批细胞立即隔离。冻存盒外再套 0.05 mm 厚 PE 密封袋，防止液氮渗入导致条码脱落。

支原体应急方案

48 h 内确认阳性：

1. 立即丢弃培养皿，5 % 次氯酸钠浸泡 30 min。
2. 生物安全柜 UV 30 min + 75 % 酒精擦拭。
3. 同期冻存管转移至隔离罐，等待药敏结果。

BM-Cyclin（泰妙菌素 + 米诺环素）组合 2 周清除率 98.7 %，但 eNOS 表达下降 15 %，需在清除后补做功能验证。

功能检测月历

每月第一周做：

• 管腔形成实验：Matrigel 6 h 毛细网络长度 ≥5 mm mm?2。
• LDL 摄取：DiI-Ac-LDL 4 h 荧光强度 ≥200 RFU。
• 渗透性：FITC-dextran 70 kDa 1 h 表观渗透系数 ≤2 × 10?? cm s?1。

任意指标低于阈值，整批细胞进入复核流程。

设备校准周期

• CO? 传感器：每季度标准气体 5 % CO? 校准，误差 ±0.1 %。
• 温度探头：每月冰水两点校准，偏差 ±0.2 ℃。
• 倒置显微镜光源：半年一次光功率计检测，衰减 >10 % 即更换灯泡。

所有校准记录上传云端，审计追踪直接导出 PDF。