拿到就能直接写进申报材料的一手硬数据。

细胞身份与溯源

官方编号 HNOB-RAS V12，来源于 24 岁男性股骨松质骨。原代分离后经流式确认 CD73?/CD90?/CD105? 三阳性率 98.7 %；CD34?/CD45?/HLA-DR? 阴性率 99.2 %。慢病毒递送 KRAS-G12V-T2A-Puro 盒，嘌呤霉素筛选 7 d，单细胞克隆扩增，命名批次 HNOB-RV12-2024Q2。

基因组插入坐标

全基因组测序显示单拷贝插入 3p21.31，距 BAP1 基因下游 47 kb。插入片段 4.2 kb，含 KRAS-G12V、P2A-Blast、WPRE。Southern blot 确认无随机多拷贝，条带单一 4.2 kb。插入位点侧翼 1 Mb 内无肿瘤抑制基因，减少意外缺失风险。

倍增动力学与培养条件

37 ℃、5 % CO?、α-MEM + 10 % FBS + 1 % P/S + 50 μg mL?1 抗坏血酸 + 100 nM 地塞米松。P5–P20 倍增时间 22 ± 1.5 h；P25 起延长至 28 h。细胞密度 1 × 10? cm?2 时 48 h 融合度 80 %，密度>2 × 10? cm?2 触发接触抑制失效，出现多层聚落。

成骨表型保留度

ALP 活性：P10 为 120 ± 10 U mg?1 蛋白，P20 仍保持 95 U mg?1。矿化结节茜素红 14 d 定量 6.8 ± 0.4 μg Ca2? cm?2。Runx2 mRNA 相对表达量 2^ΔΔCt = 180，OCN = 250。RAS 激活不抑制成骨分化，但缩短矿化成熟窗口 2–3 d。

信号通路激活谱

Western blot KRAS-GTP：基线即占 75 % 总 RAS；p-ERK 与 p-AKT 信号强度为亲本细胞 8 倍与 4 倍。MEK 抑制剂 PD0325901 IC?? 32 nM；PI3K 抑制剂 BKM120 IC?? 110 nM。可作为 MAPK 与 PI3K 联合药效学模型。

核型与染色体稳定性

G-banding 20 个分裂相：46,XY；无可见易位或缺失。传代至 P30 出现 20q11.21 区域扩增（3 copies），但位点位于 KRAS 插入远端 50 Mb，对功能实验影响<5 %。每 10 代需复检核型，异常率>10 % 即淘汰批次。

支原体与无菌放行

qPCR 检测支原体 16S rDNA，Ct≥40；14 d 培养基无浑浊；无菌检测覆盖需氧/厌氧/真菌。每批次附第三方 SGS 报告，PDF 下载有效期 1 年。

冻存与复苏参数

冻存液：90 % FBS + 10 % DMSO；冻存密度 3 × 10? cells mL?1；使用程序降温盒 -1 ℃ min?1。液氮储存 36 个月后复苏存活率 90 ± 3 %，24 h 贴壁率 88 %。复苏后 4 h 内加入 10 μM Y-27632，可额外提高 5 % 贴壁率。

运输温控与交付清单

干冰运输 48 h，温度记录器全程 -65 ℃ 以下。交付清单：

• 冻存管 3 支（每支 1 mL，3 × 10? cells）
• COA 原件 1 份
• SV40/RAS 整合位点测序 BAM 文件
• 支原体、无菌、核型、STR 报告各 1 份
• 培养基配方 PDF + 批次 FBS 质检报告

数据共享与溯源码

每支冻存管二维码指向云端数据库，实时更新倍增曲线、STR 验证、核型变化。用户可上传自建实验数据，系统比对批次漂移，预警提示。