从复苏到功能验证，全流程实操细节。

复苏：37 ℃ 水浴 90 秒计时

冻存管从液氮取出后，立即投入 37 ℃ 无气泡水浴，秒表计时 90 s。轻摇至冰晶仅剩米粒大，立即转入 9 mL 预温完全培养基稀释 DMSO。离心 200 g 3 min 去上清，重悬于 5 mL 新鲜培养基后接种。延迟 10 s 以上，膜完整性下降 5 %，直接表现为 24 h 贴壁率掉 8–12 %。

接种密度：每平方厘米 2.8 × 10? 细胞

T-25 瓶推荐接种 7 × 10? 细胞。密度低于 1.5 × 10? cm?2，细胞铺展过开，成骨表型向成纤维漂移，RUNX2 mRNA 48 h 内下降 30 %。密度高于 4 × 10? cm?2，钙结节提前 3 d 出现，但基质胶原分泌量被稀释，后期矿化层易碎裂。

培养基配方与换液节奏

基础：α-MEM + 10 % FBS（经成骨诱导验证批次）+ 1 % P/S + 50 μg mL?1 抗坏血酸 + 10 mM β-甘油磷酸 + 100 nM 地塞米松。每 48 h 全量换液；24 h 半换液会导致磷酸盐积累，钙结节呈泥沙状，拉曼光谱 960 cm?1 峰半高宽增大，提示晶体无序。

37 ℃ 与 33 ℃ 切换：SV40T 的温控开关

SV40T 在 37 ℃ 持续激活，细胞倍增 28 h；需同步成骨分化时，第 0 d 起降至 33 ℃，T-antigen 表达下降 70 %，pRb 恢复部分活性，周期放缓至 42 h，ALP 活性同步升高 2.1 倍。温控误差 ±0.3 ℃ 内可重复；超出 0.5 ℃ 时 RUNX2 与 OSX 表达离散度>20 %。

消化传代：胶原酶 + EDTA 双酶法

0.1 % 胶原酶 II 37 ℃ 8 min，轻晃至片层卷起，再加 0.05 % EDTA 2 min。单细胞率>90 %，传代比例 1:3 最稳。Trypsin-EDTA 常规法会导致钙结节提前脱落，钙定量结果低 15 % 以上。

冻存液升级：10 % DMSO → 7 % DMSO + 3 % 羟乙基淀粉

羟乙基淀粉可提高细胞膜玻璃化程度，复苏存活率从 82 % 提升至 93 %。冻存密度 3 × 10? cells mL?1，每管 1 mL，液氮面 1 h 过渡降温，再入罐，可保持 36 个月活性无衰减。

无菌边界：三关口

1. 复苏后 24 h 内做支原体 qPCR。
2. 每两周在培养皿盖内侧滴 200 μL 培养基，14 d 无浑浊。
3. 细胞上清 0.22 μm 滤膜后做 16S rDNA 高通量，阈值<0.1 % 非培养细菌序列。

成骨功能验证金标准

• 第 7 d ALP 染色：阳性面积>60 % 视野。
• 第 14 d 钙结节茜素红：OD 540 ≥0.8，对应 4 μg Ca2? cm?2。
• 第 21 d RT-qPCR：OCN 表达量提高 200 倍，COL1A1 提升 50 倍。

任何指标低于阈值，即视为分化失败，回溯培养基批次或温度日志。

数据记录模板

每次实验填写：接种密度、培养基批号、温度曲线、换液时间点、ALP 与钙定量原始 OD。模板内置 Excel 下拉菜单与条件格式，异常值自动标红，便于后续审计与复现。