让细胞保持收缩表型与遗传稳定，需要一套可落地的日常动作。

环境稳态：培养箱校准比换液更重要

温度、CO? 与湿度三重传感器每年至少溯源一次。温差 ±0.3 °C 即可引起收缩蛋白表达下调 15 %。校准方法：

• 使用 NIST 可追溯的温度记录仪，24 h 连续采样，绘制 CUSUM 图。
• CO? 红外传感器半年更换一次滤芯，防止漂移导致 pH 7.4 → 7.6，细胞边缘卷起。

培养基生命周期：成分降解曲线与替换节点

• FBS 批次差异大，到货后留 10 mL 做 α-SMA 表达基线，低于历史均值 20 % 立即退货。
• bFGF 半衰期 48 h，周三补加 2 ng/mL 可替代周末换液。
• 2-巯基乙醇氧化后颜色由淡黄变深棕，肉眼可见即可弃用。

传代动作：TrypLE 时间与细胞骨架的博弈

SV40 永生化株对胰酶敏感，TrypLE 2.5 min 时 α-SMA 应力纤维开始解聚。实操步骤：

• 预温 37 °C，镜下见细胞变圆立即加入 2 倍体积含血清培养基终止。
• 离心 200 g × 3 min，重悬后计数，存活率 < 95 % 当天不铺板。
• 每 5 代改用 0.05 % EDTA 非酶消化一次，减少剪切力损伤。

支原体哨兵：PCR 与荧光双保险

• 每月第一周取上清 200 μL，qPCR 引物覆盖 16S rRNA 保守区，Ct ≥ 35 为阴性。
• 荧光 Hoechst 33258 染色随机抽检 10 % 批次，胞外蓝色亮点 > 5/视野立即隔离。
• 发现污染，使用 BM-Cyclin 7 天方案，三轮验证阴性后方可回传。

冻存与复苏：玻璃化背后的细节

• 冻存液配方：90 % 无血清冻存液 + 10 % DMSO，4 °C 预冷 10 min 再程序降温。
• 冻存密度 5 × 10? cells/mL，每管 1 mL，贴签含批次二维码。
• 复苏水浴 37 °C 90 s，转移到 15 mL 预温培养基中，200 g 离心 3 min 去除 DMSO。
• 6 孔板过夜贴壁率 < 85 % 视为批次异常，启动售后流程。

遗传漂移监控：每 10 代一次体检

• STR 复核：与原代模板匹配度 < 90 % 立即淘汰。
• 核型 G-banding：46, XY 结构异常 > 5 Mb 需单克隆化。
• α-SMA 收缩功能：卡巴胆碱 10 μM，胶原凝胶收缩率 < 50 % 触发复壮。

常见故障排查表