把每个动作拆成秒级节拍，实验重复性才能钉在纸面上。

开箱即检：冻存管 90 秒复苏脚本

液氮罐提桶到水浴锅距离 ≤ 1.5 m，计时器设 90 s。

• 第 0–10 s：37 °C 水浴轻摇，管壁冰晶消失即取出。
• 第 11–30 s：75 % 酒精喷洒管盖，超净台内旋松 1/4 圈释放压力。
• 第 31–60 s：1 mL 预温完全培养基沿管壁缓慢滴加，减少渗透冲击。
• 第 61–90 s：移液器混匀后转入 15 mL 离心管，200 g × 3 min 去 DMSO。

贴壁率 < 85 % 当日不铺板，直接联系技术支持。

铺板密度与收缩功能：每平方厘米 3.2 万个细胞的来历

SV40T 永生化株在 3.2 × 10? cells/cm2 时 48 h 形成融合单层，卡巴胆碱刺激收缩幅度最大。低于 2 × 10? 细胞拉丝，高于 5 × 10? 出现多层堆积，信号噪音比直线上升。

实操：6 孔板每孔 9.6 × 10? cells，误差 ±5 % 用电动移液器一次完成。

培养基预配：一次配 500 mL，用 7 天不变质

• 基础：DMEM/F12 400 mL + 2 % FBS 100 mL，0.22 μm 过滤。
• 添加：rhKGF 10 ng/mL、胰岛素 5 μg/mL、Y-27632 2 μM（前 48 h）。
• 分装：50 mL 离心管，4 °C 避光，每日取 1 管避免反复开瓶。

pH 监控：每天同一时间点取样 2 mL，pH 7.30–7.45 为绿灯区，>7.50 立即换液。

传代节拍：TrypLE 2 min 15 s 的临界点

镜下 80 % 细胞变圆即停表，平均耗时 2 min 15 s。

• 预温 TrypLE 到 37 °C，缩短 20 % 时间。
• 加入 2 倍体积含血清培养基终止，吸管头贴壁冲 3 次，单细胞率 > 95 %。
• 计数后 1 : 3 传代，超过 1 : 4 倍增时间延长 8 h。

收缩实验即时操作卡

冻存回冲：一支管一次用完

复苏后剩余细胞活性下降快，规定“一管一次”。

• 冻存密度 5 × 10? cells/mL，1 mL/管。
• 冻存盒降温速率 -1 °C/min，过夜后入液氮。
• 回冲时同一批次只开一支，避免梯度冻融。

污染应急：72 h 内三步走

• 第 0–6 h：发现浑浊立即拍照、标记位置。
• 第 6–24 h：取 200 μL 上清做 qPCR 支原体检测。
• 第 24–72 h：阳性启动 BM-Cyclin 方案，阴性继续观察两轮换液后结案。

所有操作在独立培养箱完成，避免交叉气流。

实验记录模板：让下一任接手零障碍

• 每日记录：传代次数、培养基批号、pH、细胞形态照片。
• 每周记录：收缩率、倍增时间、支原体抽检结果。
• 每月记录：STR 复核、核型图、α-SMA 表达灰度值。

模板固定为 Excel 在线表，自动时间戳，不可手动更改。