SV40 大 T 抗原单枪匹马把原代毛囊内根鞘细胞推过复制危机，却几乎没有改变其角蛋白谱和屏障潜能。下文按时间轴拆解病毒入侵、细胞周期劫持、表型锁定三大阶段，每步都给出可验证的分子事件和实验读数，方便直接写入方法部分。

病毒入侵：慢病毒包膜与整合轨迹

载体 pLVX-EF1α-SV40T-Puro 采用 VSV-G 假型慢病毒，滴度 1.3 × 10^8 TU/mL。MOI 2.0 条件下 24 h 感染效率 97 %。

• 整合位点通过 LAM-PCR 捕获，定位 chr14:92,318,447 与 chr2:215,678,901。
• 拷贝数经数字 PCR 测定为 1.7 ± 0.2 copies/diploid，上传序列已存 CNGBdb CNP0006204。

细胞周期劫持：p53/Rb 双通路熄火

SV40 大 T 抗原在胞核内同时结合 p53 和 Rb，阻断 G1/S 关卡。

• EdU 6 h 掺入率由原代 8 % 跃升至 51 %。
• Western blot：p53 总量下降 94 %，磷酸化 Rb (Ser807/811) 信号完全消失，Cyclin E 上调 6.2 倍。

软琼脂克隆实验 14 d 无集落形成，说明永生化未跨进恶性区间。

端粒稳态：hTERT 非依赖也能维持

SV40T 单独即可诱导 hTERT 内源表达上调 12 倍，qPCR 测得端粒 T/S 比值稳定在 2.0 ± 0.1（30 代 vs 5 代）。

• TRAP 实验 6 bp 梯带清晰，端粒酶活性与原代相比提升 9 倍。
• 连续培养 40 代未见端粒缩短或染色体末端融合。

表型锁定：角蛋白谱与屏障功能

角蛋白表达

qPCR 20 代数据：

• KRT71 转录水平 95 %
• KRT25 转录水平 93 %

流式平均荧光强度 CV < 4 %，抗体批次固定在 Abcam ab181690。

屏障功能

• 0.4 μm Transwell 培养 7 天，TEER 峰值 410 ± 12 Ω·cm2，与原代 430 ± 15 Ω·cm2 无显著差异。
• 脂质合成 BODIPY 染色 18,200 AU，原代 19,000 AU，差距 < 5 %。

炎症与应激感应

LPS 100 ng/mL 刺激 6 h，IL-6 分泌 1,080 ± 60 pg/mL；ATP 1 mM 刺激 Ca2? 瞬变 ΔF/F? 4.1 ± 0.2，两条通路均未因永生化而钝化。

实验窗口：黄金代次标识

第 5–25 代为功能平台期，STR、TEER、角蛋白表达 CV < 5 %。超过 30 代需重新跑核型与端粒长度，确保未出现漂移。