先厘清实验场景：为什么必须选 SV40T 永生化株

人毛囊内根鞘细胞（hIRS）原代分离后极易进入复制衰老，最多传代 4-6 次就失去增殖能力。SV40 Large T 抗原通过抑制 p53 与 Rb 通路，将细胞周期锁定在增殖状态，把有限寿命延长到 50 代以上。若研究周期超过 4 周、需要基因编辑或构建体外毛囊模型，永生化株是唯一可行路径。

细胞来源与传代历史：别只看“人源”二字

• 组织来源：枕部头皮、胡须毛囊、眉毛毛囊三种常见供区。枕部毛囊雄激素受体表达低，适合雄激素依赖性研究；胡须毛囊 Wnt 信号活跃，利于毛干分化实验。
• 分离方法：外植块法获得的细胞混杂角质形成细胞比例高，流式分选法纯度高但成本翻倍。
• 永生化节点：在原代 P1 还是 P3 引入 SV40T 会决定后期表型保留程度。P1 引入基因漂移小，但操作难度大；P3 引入成功率高，却可能丢失部分内根鞘特异性标记。

质量认证体系：把证书拆开看

• STR 鉴定：16 位点匹配度 ≥90%，排除 HeLa、HaCaT 等常见污染株。
• 支原体检测：qPCR 法灵敏度 10 cfu/mL，比传统 Hoechst 33258 更可靠。
• 无菌报告：细菌和真菌双阴性是底线，额外要求分枝杆菌筛查才能用于移植模型。
• SV40T 整合拷贝数：数字 PCR 定量 1-3 拷贝/基因组，过高拷贝会导致基因组不稳定。

功能验证指标：让数据替卖家说话

• 毛鞘特异性标记 KRT71、KRT25 表达量：Western blot 灰度值不低于原代细胞的 80%。
• 脂质合成能力：尼罗红染色荧光强度 ≥200 RFU，反映内根鞘角质形成细胞的分化潜能。
• 3D 毛囊球体形成效率：悬滴培养 7 天，球体直径 80-120 μm 且层粘连蛋白 IV 阳性。
• 基因编辑兼容性：CRISPR 单切割效率 ≥70%，双等位基因敲除效率 ≥40%。

价格陷阱与批次差异：算清总拥有成本

• 单管冻存报价：人民币 3000-8000 元区间，隐藏费用在于培养基配套。无血清培养基每 500 mL 加价 1200 元，若实验需 2 L 培养基，隐性成本直接翻倍。
• 批次溯源：同一捐赠者的不同批次可能因冻存密度差异导致复苏存活率波动 20%。要求卖方提供批次 COA 并留存 2 支备份冻存管，避免重复采购。
• 售后条款：7 天内细胞存活率低于 80% 免费补发是行业惯例，额外要求提供实验补救技术支持可写入采购合同。

运输与复苏：细节决定首代存活率

• 干冰运输：48 h 内到货，箱内温度记录曲线需全程低于 -60 °C。
• 复苏流程：37 °C 水浴 90 s 后立刻加入 9 mL 预温完全培养基，离心 200 g × 3 min，去除 DMSO 残留。次日贴壁率 <70% 直接联系技术支持，勿盲目继续传代。

培养系统兼容性：别等细胞到了再改 SOP

• 基底培养基：DMEM/F12 添加 5 μg/mL 胰岛素 + 10 ng/mL KGF 是通用配方，若实验室已配置 KGM-2 可无缝衔接。
• 包被基质：0.1 mg/mL 鼠尾胶原 I 型足够维持形态，若需无动物源体系，改用重组人层粘连蛋白 511 E8 片段。
• 气体环境：5% O? 低氧培养可延缓 SV40T 引发的应激反应，延长对数期 2-3 天。

长期维护与表型漂移监控

• 每 5 代进行一次 KRT71 qPCR 定量，ΔCt 值升高超过 1.5 即判定表型漂移，需重新克隆化。
• 冻存密度 5×10? cells/mL，液氮气相存储，复苏存活率可保持 90% 以上。
• 每年做一次全基因组 STR 复核，防止交叉污染导致的“静默替换”。