永生化细胞不是“放培养箱就不用管”的消耗品。SV40 大 T 抗原给了小胶质细胞超长待机，也带来代谢压力、基因组漂移、支原体易感三重隐患。下面把实验室里真正奏效的预防、诊断、修复动作写成可执行的周历，每步都附带判定标准，让细胞在 50 代之后依旧保持原代特征。

每日巡检：显微镜下的 30 秒判读

形态红线

原代小胶质细胞呈“阿米巴”或“分枝状”；永生化株若出现大量圆形、无突触细胞，预示激活过度或基因组漂移。每天同一时间段用 20× 物镜随机拍 3 个视野，计算分枝细胞比例 < 60 % 即触发排查。

培养基颜色

pH 指示剂酚红在 24 h 内由红转橙黄，提示乳酸堆积。立即换液并检测 CO? 浓度，确保 5 % ± 0.2 %。

每周体检：三指标锁定早期异常

月度深度维护：基因组稳定性扫描

STR 指纹

每 5 代做一次 16 位点 STR，与 ATCC 原始数据比对 ≥ 90 %。出现位点漂移先复核试剂，确认后冷冻备份株启用。

端粒长度

qPCR T/S 比值下降 15 % 以上提示 hTERT 活性衰减，需重新转导 SV40 或更换主代株。

半年级大保养：培养体系整体翻新

培养箱高温灭菌

56 °C 干热 2 h + 紫外线 30 min，清除箱壁生物膜。完成后用无菌棉签蘸 TSB 培养基擦拭，48 h 无浑浊才算过关。

液氮罐细胞盘点

建立 Excel + 条码双系统，每管扫码核对位置、代次、日期。发现标签模糊立即重贴并同步云端备份，防止找不到种子株。

应急维修：污染突袭 48 h 内复活实验

支原体阳性

• 第 0 h：整批细胞高压灭菌
• 第 6 h：培养箱、超净台、移液器全面 2 % Virkon 擦拭
• 第 24 h：重新复苏备份株，复苏存活率 < 85 % 直接退货供应商

真菌污染

真菌孢子易在加湿盘滋生。污染发生时，连同加湿盘一起更换，改用无菌去离子水 + 0.2 μm 过滤，每日更换。

耗材与试剂轮换表

记录模板：让维修动作可追溯

建立 Notion 页面，每页对应一株细胞，字段包括：

• 当日形态照片
• 支原体 Ct 值
• 换液时间戳
• 试剂批次号
• 异常描述与处理人

所有异常记录自动同步到 Slack 频道，实验团队即时可见。