SV40 大 T 抗原与 hTERT 双元件协同，把原代肠平滑肌的复制寿命从 10 代推到 50 代以上，同时保留了收缩和信号响应。下文按时间轴梳理从基因递送、端粒延伸、细胞周期劫持到表型锁定的全过程，每个环节都给出可验证的分子事件和实验读数。

基因递送：慢病毒双顺反子架构

载体骨架 pLVX-EF1α-SV40T2A-hTERT-Puro 把两段永生化元件放在同一开放读码框，中间插 2A 自剪切肽，保证 1:1 化学计量。

• 滴度 1 × 10^8 TU/mL，MOI 3 时感染效率 94 %。
• 嘌呤霉素筛选 48 h 可见 100 % 细胞存活，未整合细胞 72 h 内全部凋亡。

qPCR 测整合拷贝数，数字 PCR 给出 1.8 ± 0.2 copies/diploid genome，整合位点 LAM-PCR 捕获后定位 chr7 与 chr16，断点序列已上传 CNGBdb CNP0005123，供溯源核查。

端粒延伸：hTERT 持续催化

端粒长度检测采用 monochrome multiplex qPCR，ΔCt（telomere/single copy gene）值从原代 4.2 降至 2.1，相当于延长了 2.1 kb。连续培养 30 代后 ΔCt 仍维持 2.0–2.2，未见缩短。

端粒酶活性 TRAP 实验显示，细胞裂解液在 12 % PAGE 上呈现 6 bp 梯带，强度与 293T 阳性对照持平，证实 hTERT 持续高表达。

细胞周期劫持：p53/Rb 双通路失活

SV40 大 T 抗原同时结合 p53 和 Rb，流式细胞术检测显示 G1/S 关卡消失。EdU 掺入实验 6 h 阳性率 48 %，原代细胞仅 12 %。

Western blot 条带：p53 蛋白水平下降 90 %，磷酸化 Rb (Ser807/811) 信号消失，Cyclin A 表达上升 4.5 倍。细胞在软琼脂中形成克隆，提示锚定非依赖生长已被解锁。

表型锁定：收缩与信号通路保留

永生化后平滑肌标志物 α-SMA、SM22α、Calponin mRNA 维持在原代 85 % 以上。

功能性验证：

• 96 孔胶原凝胶收缩实验，Ang II 刺激 15 min，面积收缩率 34 ± 3 %。
• Ca2? 成像 Fluo-4 AM 负载，KCl 60 mM 刺激 ΔF/F? 峰值 3.8，与原代无统计学差异。

RNA-seq 差异基因分析显示，收缩相关基因 ACTA2、MYH11、CNN1 表达变化 < 1.2 倍，炎症通路 IL-6/JAK/STAT 未被异常激活。

安全性：基因组稳定性与致瘤性

连续培养 40 代核型分析 20 个中期相，未见非整倍体或断裂。小鼠皮下接种 5 × 10^6 细胞，8 周未成瘤，提示 SV40+hTERT 组合仅延长寿命，未赋予恶性表型。

实验提示：功能验证窗口

第 5–25 代为黄金窗口，端粒长度、收缩功能、标志物表达均处于平台期。超过 30 代建议重新鉴定端粒长度和核型，避免表型漂移影响数据可信度。