实验设计、审稿人质疑、审计核查，所有环节都绕不开一句“请提供技术参数”。下面把这支细胞株的核心指标拆到最小颗粒度，逐项给出可溯源的数值、测定方法和出处，让任何实验室都能直接引用或复现。

基因组编辑痕迹

HPV16-E6/E7 插入位点

慢病毒载体采用 pLVX-EF1α-E6-IRES-E7-Puro，整合位点通过 LAM-PCR 捕获，测序定位 chr3:128,456,789 与 chr12:58,321,007。两份全基因组测序文件已上传至 CNGBdb（项目号 CNP0004381），下载后可自行比对断点序列。

拷贝数

数字 PCR 显示每个细胞 2.1 ± 0.3 个整合片段，拷贝数稳定至第 30 代。实验室自检可使用 Bio-Rad QX200，引物序列见附录 S1。

表型保持阈值

平滑肌标志物表达量

第 5 代、第 15 代、第 25 代的 qPCR 结果：

• α-SMA 转录水平保持原代细胞的 87 %、84 %、82 %
• SM22α 转录水平保持 90 %、88 %、85 %

抗体选用 Sigma A2547 与 Abcam ab14106，流式平均荧光强度 CV < 6 %。

收缩功能

96 孔胶原凝胶收缩实验，Ang II 刺激 15 min 后面积收缩率 31 ± 4 %，与原代 38 ± 3 % 差距在统计学置信区间外。

生长动力学

倍增时间

完全培养基（DMEM + 10 % FBS + 1 % ITS + 5 μg/mL puromycin）37 °C、5 % CO? 下，倍增时间 26.4 ± 1.2 h。使用 IncuCyte S3 每 2 h 拍照一次，Logistic 拟合 R2 > 0.99。

饱和密度

100 mm dish 峰值密度 1.8 × 10^5 cells/cm2，超过此密度 24 h 内凋亡率上升至 12 %。

稳定性与极限传代

极限代次

连续培养至第 45 代，核型分析 20 个中期相，未见非整倍体或染色体碎裂。端粒长度 qPCR 检测，第 45 代端粒 T/S 比值仍高于原代 1.9 倍，提示永生化机制持续有效。

表型漂移监测

建立内部参考标准：每 5 代做一次 STR + 标志物 + 收缩功能三合一检测，任一项偏差超过 10 % 即淘汰该批次。

药筛与基因编辑兼容性

抗生素敏感性

Puromycin 筛选曲线测定：IC?? 0.72 μg/mL，推荐维持浓度 1 μg/mL，筛选效率 100 %。

Blasticidin、Hygromycin 交叉耐受实验显示 IC?? 均 > 15 μg/mL，可做多基因共转染。

CRISPR 敲除效率

电转 1.5 μg Cas9-sgRNA RNP，72 h T7E1 检测，INDEL 频率 78 %。单细胞克隆形成率 35 %，与 HEK293 水平相当。

支原体、细菌、真菌三维质控

检测方法组合

• 支原体：qPCR（Takara）+ 培养法（PPLO broth）双阴性
• 细菌：BHI 培养 14 d，无浑浊
• 真菌：SDA 培养 14 d，无丝状或酵母样菌落

报告随货同行，存档编号与批次号绑定，支持扫码追溯。

冻存与复苏参数

冻存液配方

90 % FBS + 10 % DMSO，梯度降温盒 –1 °C / min 至 –80 °C，24 h 后转入液氮。复苏存活率 92 ± 3 %，台盼蓝法测定。

批次一致性

随机抽取 10 批次冻存管，复苏后倍增时间 CV < 5 %，STR 匹配度 100 %。

附：可直接引用的标准语句

“实验使用的人肠平滑肌细胞经 HPV16-E6/E7 永生化，STR 检测与参考株 100 % 匹配，支原体、细菌、真菌三重阴性，第 15 代 α-SMA 表达量为原代 84 %，Ang II 诱导收缩率 31 %，倍增时间 26.4 h。”